אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

שילוב גנטי של הגששים כימי לחלבונים היא שיטה חזקה כדי להקל על החקירה של היבטים מבניים ודינאמי של פונקציה של חלבונים ישירות בהקשר מקורית של תא חי. כיום, מאות חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) מצוידים עם הקבוצות כימיים שונים ביותר שניתן site-specifically לשלב חלבונים על ידי ביוסינטזה^1,2,3,4. ביניהם, אחד מוצא צילום רגיש ncAAs כגון צילום-crosslinkers⁵, בכלוב צילום^6,–^7,–^8,–⁹ חומצות אמינו צילום-להחלפה^{10, 11}, חומצות אמיניות הנושאים מאומצות alkenes ו alkynes bioorthogonal ללא זרז כימיה^{2,12,13,14,15,16 ,17}חומצות אמינו נושאת dansyl¹⁸קומרין^9,19, fluorophores²¹ prodan^20,, חומצות אמינו מצויד הגששים biophysical אחרים כמו . טוב כמו עם פוסט שינויים translational^{1,2,3,4,22,23,24,25}.

קידוד גנטי של ליגת המכללות מופעלת כברירת ייעודי אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר (AARS) לקשר של cognate משתיק קול-tRNA, אשר משלבת ncAA בתגובה ענבר stop codon במהלך הסינתזה ribosomal רגיל. ncAARS/tRNA זוגות מתוכננים כדי להיות אנכיים בתוך האורגניזם המארח, קרי לא צולבות לדבר עם זוגות אנדוגני. הטכניקה היא מבוססת היטב הן prokaryotic ו האיקריוטים המארחים והן בקלות החלים בתרבית של תאים. זוגות של התאגדות המכללות בתאים בתרבית של מבוססים על שלוש השיטות העיקריות אורתוגונלית: מערכת tyrosyl, המשלב את TyrRS של e. coli²⁶ עם משתיקול ענבר tyrosyl מ- stearothermophilus נולד ב-²⁷ (Ec TyrRS / זוג יםבסט), e. coli leucyl מערכת (EcLeuRS/tRNA^Leu_צ’ואה צמד)^6,18,28 ומערכת pyrrolysyl archaeal (PylRS/tRNA ^Pyl זוג)³, לפיה tRNA^Pyl זה משתיקול ענבר טבעי. באופן כללי, בכל המכללות מזוהה על-ידי ncAARS מיוחדים. בהתאם למבנה של ncAA, ncAARS, מתקבל באמצעות אבולוציה מכוונת של TyrRS, LeuRS או PylRS, למרות כמה synthetases יכול לקבל ncAA אחד או יותר.

הזוג אורתוגונלית מיובא לתוך התאים על ידי שימוש פשוט וקטור פלסמיד. פלסמידים נפוץ ויעיל ביותר bicistronic, לקודד גם את המעביר וגם את סינתזת ויוצרים זוג אורתוגונלית²⁹. השני פלסמיד קידוד החלבון עניין הנושאת codon ענבר באתר המיועד השינוי הוא transfected משותפת. מדיום הגידול תא פשוט נוסף ncAA. עם זאת, קבוצות מיוחדות שונות מרבים להשתמש וריאציות שונות של פלסמיד בונה גם עבור שילוב של ncAA באותה. מבנים שונים בהסדר של הגנים וקטור, סוג המעביר, השימוש codon המעביר גנים, יזם שימוש, וריאנט של tRNA, מספר קלטות ביטוי tRNA. יתר על כן, היעילות התאגדות של ncAAs שונים יכול להשתנות באופן דרסטי עקב יעילות קטליטי שונים synthetases שונים, על האיכות של tRNA, ועל אחרים גורמים³⁰. לכן חשוב שתהיה בהישג יד שיטה מהירה ואמינה כדי להעריך את היעילות של זוג אורתוגונלית, לבחור את המערכת המתאימה ביותר עבור יישום הרצויה וגם לבצע כמה פעולות אופטימיזציה לשיפור שהביטוי חלבון התשואות.

הקמנו פשוט וחזק מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית²⁹ (איור 1). ב וזמינותו, התאים הם שיתוף transfected עם פלסמיד קידוד בשביל זוג אורתוגונלית, יחד עם פלסמיד כתב bicistronic קידוד הן חלבון פלואורסצנטי ירוק הנושאת של ענבר stop codon במיקום מתירניות (EGFP^תג) ו ג’ין mCherry. קרינה פלואורסצנטית אדום וירוק של כל תא lysates נקראים בערוצים נפרדים על קורא צלחת, צלחת 96-ובכן. עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק להרכב ישירות היעילות של דיכוי ענבר, ואילו עוצמת פלואורסצנטי אדום נותן הערכה ישירה של גודל המדגם נמדד ואת היעילות תרביות תאים. לגבי מבחני דומה המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית תא בסיוע מיון (FACS) לקרוא את^31,32, וזמינותו נותן הערכה מיידית ומקיפה של ביטוי חלבון באוכלוסייה התא כולו, אשר יותר הנציגה של תנאי הניסוי הרגיל, ומציע של רכישת נתונים ועיבוד קל יותר עם תוכנה רגילה. בסך הכל, היתרון העיקרי של וזמינותו היא כי ניתן לנתח בינוני למספר רב של דגימות במקביל. שימוש assay הזה, המופרות, ספריה מעוצבת בצורה רציונלית של משתיק קול-tRNAs כדי לשפר את היעילות של מערכת אורתוגונלית Pyl³⁰. עבודה זו מתארת את נסיוני לבצע assay הזה ולהראות דוגמאות של היישום שלה, כולל אופטימיזציה של הזוג אורתוגונלית כהכנה לסיפוח צילום-crosslinking ncAA p-azido-L-פנילאלנין (עזי), השוואת התאגדות היעילות של חומצות אמינו שונות (איור 2).

במהלך השנים האחרונות, כלים ncAA הוכחו רבת עוצמה כדי לחקור מבנה ועל היבטים הפונקציונלית של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs)^{33,34,35,36,37 , 38}. בבני אדם, GPCRs יוצרים משפחה גדולה של קולטני ממברנה (800 חברים) והם מייצגים למטרות טיפוליות סמים. אפיון מבניים ישירה של GPCRs עדיין מאתגר, שיטות ביוכימיות משלימים יש צורך מאוד החקירה שלהם. אנחנו צריכים חלוץ השימוש ncAAs צילום-crosslinking למפות GPCR משטחים ולגלות ליגנד איגוד כיסים³⁴. משתמש שלנו מערכת אופטימיזציה עבור עזי התאגדות, אנחנו באופן שיטתי שולבו עזי לאורך כל juxtamembrane בתחום GPCR ישירות בתאים בתרבית של חיה. בעת הקרנת UV, עזי טפסים זן nitrene תגובתי הלוכד covalently מולקולות שכנות. כאשר המערכת נוספת של ליגנד, עזי משמשת בדיקה קרבה לחשוף אילו עמדות של הקולטן להתקרב ליגנד מאוגד. בדרך זו, מצב איגוד של ההורמון neuropeptide Urocortin (Ucn1) על הקולטן class B GPCR corticotropin שחרור-פקטור שהקלדתי (CRF1R) 1³³ היה הראשון שנחשף. לאחרונה, חשפנו איגוד ברורים דפוסים של אגוניסטים של היריבים על קולטן זהה³⁸. בגישה דומה הוחל על ידי אחרים כדי לחשוף את orthosteric ואת אתרי קישור allosteric של אחרים פפטידים, מולקולה קטנה ליגנדים על אחרים GPCRs^39,40,41,42. כתב יד זה מתאר את נסיוני חלה במעבדה שלנו עבור צילום-crosslinking מיפוי של משטחים GPCR. השיטה היא יחסית מהירה, פשוטה, אינו דורש שום ציוד מיוחד, כך הוא ישים במעבדות לביוכימיה סטנדרטי. חשוב מכך, הגישה מספק כלי חשוב לא רק כדי לזהות אתרי קישור ליגנד שבו נתונים תלת-ממדיים מבניים נדירים, אלא גם כדי להשלים במבחנה נתונים קיימים עם מידע של רצפטורים שונה לחלוטין post-translationally סביבת פיזיולוגיים של תא חי.

ההתפתחות האחרונה של הרומן ncAAs הנושאת על שרשרת צד מתאים כימיה מרביים bioorthogonal ללא זרז כימי הקבוצות נפתחה האפשרות להתקין fluorophores מהדור האחרון עבור הדמיה ברזולוציה סופר לחלבונים ישירות על חיים תאים^2,43. עוגנים כימיים לכלול מאומצות cyclooctyne SCOK¹⁴, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK^12,17, טרנס-cyclooctenes ב TCO * K^13,15,17 בין ncAAs אחרים מחסה של norbornene^16,17,44 או cyclopropene^45,46 moiety. NcAAs מגושם bioorthogonal כימיה משולבים על-ידי גרסה של PylRS בדרך כלל מסומן בתור PylRS^AF (המציין מוטציה Y271A ו- Y349F ב barkeri מ PylRS), וכן על ידי אחרים ncAARSs אד הוק התפתחו^{17 , 44}. עוגנים bioorthogonal להגיב עם ריאגנטים tetrazine⁴⁷ באמצעות דרישה אלקטרון הופכי cycloaddition תגובת דילס-אלדר לתת תפוקה גבוהה תיוג בתוך כמה דקות^43,48. עם זאת, יישום של גישה זו עוצמה לתווית GPCRs מאתגרת עקב היעילות הכוללת נמוכה של מערכת אורתוגונלית התאגדות המכללות. באמצעות המערכת שלנו Pyl משופר, לאחרונה הראו התאגדות לתפוקה גבוהה של חומצות אמינו כזה לתוך GPCRs GPCR מרביים תיוג על פני השטח של תאים בתרבית של חיים³⁰. קולטנים שכותרתו היו עדיין מתפקד, כפי שהם הפנימו פיזיולוגית בעת הפעלת הקולטן עם אגוניסט. פרוטוקול ניסיוני עבור שילוב של bioorthogonal עוגנים לתוך GPCRs, תיוג בשלבים הבאים מתוארים כאן. מצייד GPCRs עם fluorophores בהיר קטן הוא היסוד צעד לקראת לימוד GPCR dynamics מבניים בתא בשידור חי באמצעות טכניקות מתקדמות במיקרוסקופ.