多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

蚊媒介性ウイルス感染症、デング熱、チクングニア、ジカ ウイルスなどは上昇と需要の即時管理戦略では。デング熱とチクングニア ウイルスがすでにジカは西半球に¹で広がって熱帯地域の多くで流行。ジカ、デング熱のようなフラビ家族のメンバーである、1 つのアジアと 2 つのアフリカの遺伝的系統²アフリカ原産。ジカ ウイルスの同定は 1947 年にさかのぼる、にもかかわらず人間のジカ感染散発的な太平洋とアメリカ大陸に出現する前に、の半世紀のために残った。2007 年、ミクロネシアのヤップ島に発生した熱ジカの最初の報告された発生は続いてフランス領ポリネシア、2013、2014アメリカの最初の主要な発生は、2015 年にブラジルで発生しました。

ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング ウイルスは、主にネッタイシマカとヒトスジシマカによって送信されます。しかしジカ母-胎児の相互作用、性的接触を介して、授乳^3,4,5を介して可能性が広がっている、追加下流ヒト-ヒト感染の可能性があります。ジカ熱は、最初唯一の軽度の病気を引き起こすと考えられていた。しかし、それは後で大人のギランバレー症候群、新生児、および最後の月への年を可能性があります慢性の筋骨格系疾患の小頭症に関連付けられています。ジカの感染症の症状は他のウイルスの蚊拡散⁶に似ているので、ジカの病気の診断に挑戦することができます。これらのウイルスの一般的な共同感染は、鑑別診断もより挑戦的な^7,8を作る。したがって、コントロールと予防措置を開始し、患者のケア⁹を管理する、リアルタイムで疫学を理解するからジカと他のウイルス核酸の迅速かつ信頼性の高い検出が必要です。

これらのウイルスの現在の診断テストには、血清学的検査、ウイルス分離、ウイルス シーケンシング、および逆転写 PCR (RT-PCR) が含まれます。標準的な血清学的手法がしばしば不十分な感度に苦しんで、結果以前他の発現によって感染している患者での交差反応性によって複雑になることができます。

したがって、核酸テストを検出し、これらのウイルスを区別する最も信頼性の高い方法になります。ジカと他蚊媒介ウイルスの検出が通常、RT-PCR 法やリアルタイム RT-PCR 体液、血清、尿、唾液、精液、母乳、脳液^10,11などの様々 なを使用して実行されます。彼らは以下の PCR 阻害、高ウイルス量、長期間とコレクションと^12,13を処理の簡易化のためのウイルスの存在を示すので、尿および唾液のサンプルは、血液より一般に優先されます。RT-PCR ベースの診断テストは、ただし、広範なサンプル準備のステップと少ないポイント ・ オブ ・ ケアなどに最適、高価な熱サイクリング機器を構成します。

逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は、その高い感度と特異性¹⁴のための強力な RT-PCR の代替として登場した、生物の阻害物質のための許容のサンプル¹⁵、大幅削減分析複雑さとコスト、低い資源の環境に適している単一の温度の操作。RT ランプ、クラシックで実装されている、6 種類のプライマー RNA ターゲット内で 8 つの異なる領域にバインドで構成されます。60 ° C 〜 70 ° C の一定温度で実行して強い鎖置換活性と逆転写酵素と DNA ポリメラーゼを使用しています。

RT ランプの初期段階では、前方と後方内部プライマー (FIP と BIP、図 1 a) 外側前方と後方のプライマー (F3 と B3) と一緒にはダンベル構造、ランプの指数関数的増幅の種子構造を形成します。増幅はループ前方と後方のプライマー (LF と LB)、ダンベルの単一の孤立した地域にバインドするように設計は、促進、複数の繰り返しのあるコンカテマーの形成の結果ループ¹⁶。クラシック ランプに基づいて濁度の試金または DNA 間の染料をインターカ レートによる読み出しは多重化のいくつかのレベルが、ジカのポイント ・ オブ ・ ケア検出希望^17,18,19完全に適しています。オフのターゲット増幅による偽陽性を生成する傾向があると多重は簡単に得これらのシステムでないです。

これらの問題を管理するには、は、文学は、古典的な RT ランプ アーキテクチャ^20,21,22に「鎖置換プローブ」の形で追加コンポーネントを追加します。各プローブにはシーケンス固有の二重鎖領域と一本鎖プライミング領域。一本鎖領域にプローブが付いている 5′-fluorophore と 3′ 末端クェンチャーで相補的プローブを変更します。ターゲットがない場合は、近くに fluorophore とクエンチャをもたらす相補的プローブ ストランドの交配による蛍光は認められなかった。ターゲットの存在下で蛍光プローブの一本鎖部分はターゲットの補数にバインドし、変位ポリメラーゼ鎖によっては拡張されます。逆のプライマーによってさらにポリメラーゼ伸張蛍光(図 1 b)の排出量をできるように、その相補的な蛍光に分類されたストランドからクェンチャー鎖の分離を原因します。この設計では、誤検知信号の可能性を減らすこと、ダンベル形成後信号が生成されます。

鎖置換プローブの二重鎖の部分は、任意のシーケンスをすることができ、多重化が適用されると、同じシーケンスが使用異なる fluorophore クェンチャーのペア。このアーキテクチャやウイルスに汚染された尿、血清、蚊にサンプル紙に踏み付け直接試験サンプル準備なしに導入されました。30-45 分以内で生成された人間の目に目に見える三色の蛍光進み、信号が青色 LED とオレンジ色のフィルターを使用して、3 D プリントされた観測ボックスによって想像されたもの。RT ランプ試薬を凍結乾燥、冷凍を必要としないリソース設定を下げるキットの展開が有効になっています。