Amplificazione isotermica multiplex basato su piattaforma diagnostica per rilevare Zika, Chikungunya e Dengue 1

Le infezioni virali trasmesse dalle zanzare, incluse dengue e chikungunya virus di Zika sono sulle strategie di gestione immediata ascesa e la domanda. Dengue e chikungunya virus sono già endemico in molte regioni tropicali dove Zika sta ormai dilagando in emisfero occidentale¹. Virus di Zika, come dengue, è un membro della famiglia Flaviviridae ed è originario dell’Africa con una asiatica e due stirpi genetici africano². Anche se l’identificazione del virus Zika risale al 1947, Zika infezione in esseri umani è rimasto sporadico per mezzo secolo prima di emergere nel Pacifico e nelle Americhe. Il primo focolaio segnalato di Zika febbre si è verificato su Isola di Yap, Stati federati di Micronesia nel 2007, seguita da Polinesia francese nel 2013 e nel 2014. Il primo focolaio principale nelle Americhe si è verificato nel 2015 in Brasile.

I virus di Zika, chikungunya e dengue sono principalmente trasmessi da Aedes aegypti e Aedes albopictus. Tuttavia, Zika ha trasmissione umano–umana a valle ulteriori possibilità, probabilmente viene diffuso attraverso il contatto sessuale, l’interazione madre-di-feto e tramite l’allattamento^3,4,5. Zika febbre prima credeva di causare una malattia solo lieve. Tuttavia, fu più tardi associato con la sindrome di Guillain-Barré in adulti, microcefalia in neonati e malattie del sistema muscoloscheletrico cronici che possono durare mesi e anni. Diagnosi di malattia di Zika può essere difficile, poiché i sintomi di un’infezione di Zika sono simili a quelli di altri di zanzara-diffondere virus⁶. Co-infezioni comuni di questi virus fanno diagnosi differenziale ancora più impegnativo^7,8. Pertanto, rilevazione rapida e affidabile degli acidi nucleici da Zika e altri virus è necessario per comprendere l’epidemiologia in tempo reale, per avviare il controllo e le misure preventive e di gestire la cura paziente⁹.

Test diagnostici correnti per questi virus includono analisi sierologiche, isolamento del virus, sequenziamento del virus e PCR d’inversione-trascrizione (RT-PCR). Gli approcci sierologici standard spesso soffrono di sensibilità inadeguata e risultati possono essere complicati da reattività crociata in pazienti che sono stati infettati in precedenza da altri flavivirus.

Di conseguenza, degli acidi nucleici testing rimane il modo più affidabile per rilevare e distinguere questi virus. Rilevamento di Zika e altri virus zanzara è di solito eseguita mediante RT-PCR o RT-PCR in tempo reale in varietà di fluidi biologici, come siero, urina, saliva, sperma, latte materno e fluido cerebrale^10,11. Campioni di urina e saliva sono generalmente preferiti sopra anima, poiché esibiscono meno PCR-inibizione, più alti carichi virali, presenza di virus per lunghi periodi di tempo e una maggiore facilità di raccolta e gestione delle^12,13. Test diagnostici basati su RT-PCR, tuttavia, comprendere la procedura di preparazione del campione vasto e costose attrezzature ciclismo termica, rendendolo meno ottimale per il point-of-care.

Retrotrascrizione amplificazione isotermica mediata da loop (RT-LAMP) è emerso come una potente alternativa di RT-PCR, grazie alla sua elevata sensibilità e specificità¹⁴,¹⁵, campioni di relativa tolleranza per sostanze inibitorie in biologico e operazione singola temperatura, che significativamente si abbassa tenore complessità e costi associati, che lo rende adatto per ambienti di risorse in esaurimento. RT-LAMP, come classicamente è implementato, comprende sei iniettori che si legano a otto regioni distinte all’interno del RNA dell’obiettivo. Funziona a temperature costanti tra 60 ° C e 70 ° C e utilizza una trascrittasi inversa e una polimerasi del DNA con filo forte spostando attività.

Durante le fasi iniziali di RT-LAMP, avanti e indietro interni iniettori (FIP e BIP, Figura 1A) con primer esterno avanti e indietro (F3 e B3) formano una struttura con manubri, la struttura di seme di amplificazione esponenziale di lampada. Amplificazione è ulteriormente accelerato tramite i ciclo avanti e indietro gli iniettori (LF e LB), che sono progettati per associare le singole regioni non recuperabili di dumbbell, e risultati nella formazione di concatemeri con ripetere più cicli¹⁶. LAMPADA classica analisi basata su torbidità o lettura di DNA intercalanti coloranti non è completamente adatta per rilevazione di point-of-care di Zika, dove un certo livello di multiplazione è voluto^17,18,19. Multiplexing non è facilmente ottenuti in questi sistemi, come sono inclini a generare falsi positivi a causa di amplificazioni fuori bersaglio.

Per gestire questi problemi, la letteratura aggiunge un componente supplementare sotto forma di una “filo-spostando la sonda” il^21,20,di architettura classica RT-LAMP²². Ogni sonda è una regione del doppio filamento di sequenza-specifico e una regione di adescamento singolo filamento. La sonda con la regione di singolo filamento è etichettata con un fluoroforo 5′ e la sonda complementare viene modificata con un quencher estremità 3′. In assenza di un obiettivo, fluorescenza non è osservata a causa di ibridazione dei fili sonda complementare, che porta il fluoroforo e quencher in stretta vicinanza. In presenza di un bersaglio, la porzione di filamento singolo della sonda fluorescente si lega al suo complementare sul bersaglio e viene quindi esteso da un filamento spostando della polimerasi. Ulteriore estensione della polimerasi di iniettori d’inversione provoca la separazione del filo del quencher dal suo filone fluorescente contrassegnati complementari, consentendo l’emissione di fluorescenza (Figura 1B). Con questo disegno, il segnale viene generato dopo la formazione di dumbbell, riducendo le possibilità di falsi positivi segnali.

La parte di double-stranded della sonda strand-spostando può essere qualsiasi sequenza, e quando viene applicato il multiplexing, la stessa sequenza può essere utilizzata con coppie diverse fluorophore-quencher. Con questa architettura, contaminati dal virus dell’urina, siero o zanzara campioni schiacciati sulla carta sono stati introdotti direttamente il dosaggio senza preparazione del campione. Letture di tre colori di fluorescenza visibile all’occhio umano sono stati generati all’interno di 30-45 min, e i segnali sono stati visualizzati da una finestra di osservazione 3D-stampato che utilizza un LED blu e un filtro arancione. Liofilizzazione i reagenti RT-LAMP attivata la distribuzione di questo kit per abbassare le impostazioni delle risorse senza la necessità di refrigerazione.