Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

Quando le cellule B associare polarizzati matrici di antigeni (ad es., visualizzato sulla superficie dell’antigene-presentare cellule (APC)), il recettore della B-cellula risultante (BCR) segnalazione unità la formazione di una struttura classica sinapsi immuni, che era prima descritto in T cellule^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13}. Inizialmente, microclusters di form di BCRs antigene associato alla periferia del sito contatto B cellulare: APC. Questi microclusters quindi spostare verso il centro del sito contatto antigene, dove si fondono in un cluster centrale attivazione supramolecolari (cSMAC) che costituisce il nucleo della sinapsi immune. Formazione della sinapsi immuni ottimizza la segnalazione di BCR e facilita l’estrazione dell’antigene BCR-mediata dalla membrana APC¹⁴. Questa acquisizione di antigene, che è seguita da BCR-mediata antigene internalizzazione e l’elaborazione successiva dell’antigene, permette alle cellule di B di presentare i peptide: MHC II complessi alle cellule di T e suscitare la cellula T Guida¹⁴. Perché la formazione della sinapsi immunitaria promuove l’attivazione delle cellule B, chiarire i meccanismi che stabiliscono che questo modello funzionale dell’organizzazione del ricevitore può offrire nuove intuizioni in risposte immunitarie umorali come sono avviate e regolati.

Riorganizzazione dell’actina sia microtubule cytoskeletons è essenziale per la formazione della sinapsi immuni. Segnalazione stimolata da una matrice spazialmente polarizzato degli antigeni localizzati di BCR induce rapida e drammatica rimodellamento del citoscheletro dell’actina^1,15. La formazione di strutture dendritiche actina alla periferia della cellula B esercita forze che spinge sulla membrana plasmatica e promuove la diffusione delle cellule di B. Questo permette alla cellula di B di acquisire una maggiore area di superficie del antigene-cuscinetto e aumenta il numero di BCRs che legano l’antigene e attivare vie di segnalazione di BCR. Allo stesso tempo, il MTOC e la rete dei microtubuli sono riorientati verso il sito di contatto dell’antigene. All’approssimarsi del contatto dell’antigene il MTOC, microtubuli che emana dal MTOC si estendono lungo la faccia interna della membrana del plasma all’interfaccia fra la cellula di B e l’antigene-cuscinetto superficie^16,17. Questi microtubuli juxtamembrane possono quindi fungere da tracce per il movimento centripeto dineina-mediata di antigene associato BCR microclusters¹⁸, portando alla formazione di un cSMAC.

Il riorientamento e la polarizzazione del MTOC verso la sinapsi immunitaria richiede l’actina intatto e cytoskeletons dei microtubuli e spesso dipende dalle interazioni tra l’actina corticale rete e microtubuli^{16,17, 19,20}. Proteine leganti l’actina corticale, come IQGAP1, possono catturare i microtubuli interagendo con complessi proteici che decorano il microtubulo plus-estremitಹ. Questi dinamici complessi delle proteine leganti plus-fine includono EB1 e CLIP-170, che vengono definiti collettivamente come microtubule plus-fine rilevamento delle proteine (+ puntali)^21,22. + Suggerimenti alle estremità dei microtubuli possono associare alle proteine che sono associate con la membrana plasmatica o il citoscheletro di actina corticale. In questo modo i meccanismi di generazione di forza (ad es., il meno-end diretto movimento di dineina corticale ancorata lungo i microtubuli) per esercitare forze di trazione su microtubuli e quindi riposizionare il MTOC. CLIP-170 può legarsi alla proteina actina-collegati ponteggi IQGAP1²³, e abbiamo dimostrato che entrambi di queste proteine sono necessari per polarizzazione indotta da BCR MTOC verso il sistema immunitario sinapsi¹⁷. Questa interazione IQGAP1-CLIP-170 può giocare un ruolo chiave nel coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina con il riposizionamento della rete dei microtubuli alla sinapsi immune della B-cellula.

Microscopia a fluorescenza convenzionale ha rivelato la riorganizzazione drammatica della cytoskeletons actina e dei microtubuli durante la B-cellula immunitaria sinapsi formazione². Tuttavia, questo approccio non può risolvere piccole strutture cellulari in dettaglio a causa del limite di diffrazione della luce, che, secondo la legge di Abbe, dipende dalla lunghezza d’onda della luce utilizzata per illuminare il campione e l’apertura del obiettivo²⁴. Questo limite di diffrazione vincola la risoluzione dei microscopi ottici convenzionali a 200-300 nm in direzione laterale e 500-700 nm nella direzione assiale²⁵. Di conseguenza, più piccole strutture subcellulari, come pure i dettagli degli cytoskeletons actina e dei microtubuli, potrebbero solo essere osservati usando la microscopia elettronica. Formazione immagine di microscopia elettronica del citoscheletro è che richiede tempo, richiede protocolli fissazione e preparazione del campione duro che possono alterare strutture biologiche ed è limitata alla rilevazione dell’anticorpo-mediata. La capacità di immunostain e contemporaneamente l’immagine più proteine o strutture cellulari è un vantaggio notevole di microscopia di fluorescenza. Inoltre, che esprimono le proteine di fusione fluorescenti in cellule permette l’imaging in tempo reale ed è utile quando gli anticorpi efficaci per immunostaining la proteina di interesse non sono disponibili.

I recenti progressi tecnologici nella microscopia di Super-risoluzione hanno superato i limiti di diffrazione della luce e ha permesso la visualizzazione di nanoscala strutture cellulari²⁴. Una tale tecnica di microscopia di Super-risoluzione viene chiamato emissione stimolata svuotamento (STED) microscopia. STED impiega due laser, dove un laser eccita il fluoroforo e un secondo laser con un motivo a forma di ciambella selettivamente sopprime l’emissione di fluorescenza intorno il fluoroforo. Questo riduce la funzione di punto di diffusione (zona apparente) di una singola particella fluorescente e fornisce un limite di Sub-diffrazione immagine fluorescente^25,26. Microscopia di stato fondamentale svuotamento impiega anche tecniche basate sulla fluorescenza per acquisire immagini di Super-risoluzione. Tuttavia, i tempi di acquisizione e ricostruzione di immagine sono lunghi, ci sono solo un numero limitato di fluorofori che possono essere utilizzato, e l’imaging ad alta risoluzione simultanea di più componenti citoscheletriche è tecnicamente impegnativo, perché mantenere strutture di actina e microtubuli richiede le procedure di fissaggio diversi. Di conseguenza, STED ha più vantaggi rispetto la microscopia elettronica e altre microscopia di Super-risoluzione si avvicina in quanto esso offre acquisizione rapida di immagini, ha i requisiti minimi di post-elaborazione e impiega la stessa fluorofori e tecniche di colorazione che vengono utilizzati per microscopia di fluorescenza convenzionale di campioni fissati²⁶.

Microscopia di Super-risoluzione ora è stata utilizzata per visualizzare le strutture di actina alla sinapsi immune in cellule natural killer (NK) e T cellule^{26,27,28,29,30, 31}. Tuttavia, la formazione immagine di Super-risoluzione del citoscheletro dei microtubuli, così come la riorganizzazione coordinata della cytoskeletons di actina e dei microtubuli durante la formazione della sinapsi immuni, solo recentemente è stato segnalato¹⁷. Abbiamo usato la microscopia STED per celle di immagine B che erano state lasciate a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che stimolano la segnalazione di BCR e avviare la riorganizzazione del citoscheletro. Quando placcato sugli anticorpi anti-Ig immobilizzati, le cellule B subiscono drammatica diffusione actina-dipendente, che ricapitola gli eventi iniziali durante la formazione della sinapsi immuni. D’importanza, microscopia STED ha rivelato i dettagli dell’anello dendritica di F-actina che forme alla periferia del sistema immunitario sinapsi e ha mostrato che il MTOC, come pure i microtubuli collegati ad esso, avevano spostato vicino l’antigene contatto sito¹⁷. Questi microtubuli esteso verso l’esterno verso l’anello periferico di F-actina. Inoltre, formazione immagine di STED multi-colore di varie combinazioni di F-actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etichettato CLIP-170 + suggerimenti ha indicato che microtubule plus-estremità segnata da CLIP-170-GFP erano strettamente associata con il reticolo di actina periferici e con IQGAP1, un corticale cattura proteina¹⁷.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l’actina e microtubule cytoskeletons alla sinapsi immune usando la microscopia STED di imaging. Questi metodi sono stati ottimizzati utilizzando la linea A20 murino delle cellule di B, che è stato ampiamente impiegata per lo studio della segnalazione di BCR e immuni sinapsi formazione^{17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39}. perché gli anticorpi commerciali a CLIP-170 non hanno funzionato bene per immunostaining in precedenti esperimenti, descriviamo dettagliatamente l’espressione della GFP-etichettato CLIP-170 in cellule A20, con macchiatura dei protocolli per visualizzare contemporaneamente fino a tre componenti del citoscheletro o proteine associate al citoscheletro. Metodi per l’utilizzo di microscopia STED all’actina di immagine a livello delle sinapsi immune delle cellule NK sono stati descritti in precedenza⁴⁰. Qui, estendiamo questo per l’acquisizione di immagini ad alta super-risoluzione multi-colore di actina sia microtubule cytoskeletons in cellule di B.

Una considerazione critica per microscopia di Super-risoluzione è utilizzando le procedure di fissazione appropriato per il mantenimento di strutture cellulari e prevenendo danni to le proteine fluorescenti. La fissazione e la macchiatura metodi presentati qui sono stati ottimizzati per conservare la fluorescenza di GFP e fornire imaging ad alta risoluzione delle reti di actina e dei microtubuli. Quando è necessario esprimere proteine fluorescenti, dovrebbe essere notato che le cellule B sono solitamente difficili a transfect. Usando questo protocollo, 20-50% di A20 cellule tipicamente esprimono la proteina di fusione GFP transfettata, e fra questa popolazione i livelli di espressione della proteina sono variabili. Tuttavia, super-resolution imaging di actina e i microtubuli utilizzando le procedure che descriviamo è abbastanza robusta e immagini di alta qualità sono facilmente ottenute. Nonostante le piccole dimensioni rispetto a cellule A20, mostriamo che queste procedure utilizzabile anche all’immagine della rete dei microtubuli in cellule primarie di B che sono stati attivati brevemente con il lipopolysaccharide (LPS). Abbiamo dimostrato che cellule di B primarie LPS-attivato possono trasfettate con siRNA a relativamente alta efficienza (cioè, tale che lo svuotamento della proteina può essere rilevato dall’immunoblotting), che li rende una buona alternativa all’uso di linee di cellule di B per alcuni studi ¹⁷.