Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.
Abstract
Tierischen und pflanzlichen Gewebe besteht aus unterschiedlichen Populationen von Zellen. Diese Zellen interagieren im Laufe der Zeit zum Aufbau und Erhalt des Gewebes und können verursachen Krankheit wenn gestört. Wissenschaftler haben clevere Techniken um Eigenschaften und natürliche Dynamik dieser Zellen innerhalb von intaktem Gewebe zu untersuchen, zum Ausdruck bringen, fluoreszierende Proteine in Teilmengen von Zellen entwickelt. Jedoch erfordern manchmal Experimente mehr ausgewählten Visualisierung von Zellen im Gewebe, manchmal auf die einzelne Zelle oder Bevölkerung der Zellen Art und Weise. Um dies zu erreichen und Einzelzellen innerhalb einer Bevölkerung der Zellen zu visualisieren, haben Wissenschaftler einzellige Ladungszustand der fluoreszierende Proteine genutzt. Um diese Technik zu demonstrieren, zeigen wir hier wie UV-Licht auf eine Eos exprimierenden Zelle des Interesses an einem intakten, direkte Leben Zebrafisch. Wir Bild dann diese Photoconverted Eos+ Zellen 24 h später um festzustellen, wie sie im Gewebe verändert. Wir beschreiben zwei Techniken: einzelne Zelle Ladungszustand und Photoconversions der Bevölkerung der Zelle. Diese Techniken können verwendet werden, zu visualisieren, Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Schicksal und Differenzierung und Zelle Migrationen, so dass es eine Technik, die in zahlreichen biologischen Fragestellungen anwendbar ist.
Introduction
Mehrere unterschiedliche Zellen interagieren, um aufzubauen und zu pflegen komplexe tierischen und pflanzlichen Geweben. Diese Zellen sind oft eingefügten und schwer zu unterscheiden von Nachbarn auf eine einzelne Zellenebene ohne Hochauflösende Mikroskopie, die Fixierung des Gewebes erfordern. Zu verstehen, wie diese Gewebe bilden, sind gepflegt und werden krank, es war jedoch wichtig, zu untersuchen, wie einzelne Zellen im Gewebe sind im Laufe der Zeit interagieren. Idealerweise benötigen diese Experimente die Kennzeichnung einzelner Zellen innerhalb eines Gewebes in einer nicht-invasive Weise ohne das Erfordernis einer Fixierung. Wissenschaftler haben jetzt zahlreiche Techniken, um diese Aufgabe1,2,3,4zu erreichen entwickelt.
Die Entdeckung und Umsetzung von Quallen grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde ein spannender Ansatz, der für die Kennzeichnung von verschiedenen Zellen in einem Gewebe Umwelt1erlaubt. Mit zellspezifische Promotoren, ist es möglich, eine Teilmenge von Zellen genetisch zu wählen, die1bezeichnet werden. Alternativ kann virale induzierte Expression von GFP vom Benutzer ausgewählte Ausdruck der GFP3,4einsetzbar. Obwohl ziemlich nützlich, erlaubt vermittelten Genexpression der GLP nicht vom Benutzer ausgewählte Ausdruck in einer Teilmenge von Zellen im Gewebe; und virale Ausdruck der GFP, zwar vorteilhaft, kann invasive. Mit dem Aufkommen von GFP-Derivaten und clevere Techniken wie Brainbow verschiedene fluoreszierende Proteine mehr spärlich in den Geweben zum Ausdruck zu bringen ist es möglich, einzelne Zellen und die Interaktionen zwischen ihnen in komplexen Gewebe2, zu visualisieren geworden. 5. jedoch diese Ansätze Zellen in einer zufälligen beschriften. Wenn das gewünschte Experiment erfordert Visualisierung einer einzelnen Zelle oder Population von Zellen, die durch den Versuchsleiter definiert ist, sind sie daher beschränkt. Mit solchen Experimenten wäre es vorteilhaft, ein genetisch ausgedrückt fluoreszierendes Protein zu haben, die manipuliert werden können, um in eine einzelne Zelle Art und Weise unterscheiden es von anderen Leuchtstofflampen und nicht fluoreszierenden Zellen.
Um dieses Ziel zu erreichen und die Zellbiologie einzelner Zellen innerhalb einer komplexen lebendes Gewebe zu visualisieren, nutzt die wissenschaftliche Gemeinschaft Einzelzelle Ladungszustand verschiedene fluoreszierende Proteine6,7,8. Mit genetisch kontrolliert Ausdruck eines Photoconvertible Proteins (z.B. Eos, Kaede, etc.), die Übergänge von Grün auf rot fluoreszierenden UV ausgesetzt (488 nm) Licht, können wir eine einzelne Zelle unterscheiden, von seiner Eindringmittel beschrifteten Nachbarn6,7,8. Dieser Ansatz nutzt eine Vorrichtung an unsere confocal Mikroskop das Licht von einem Laser-Stapel zu einer Beugung begrenzte Region of Interest kann direkt angeschlossen. Mit dieser Technik können wir entweder einzelne Zellen oder größere Populationen in einem frei definierbaren Weise9,10,11beschriften. Die Technik ist minimal-invasiv im Vergleich zu einzelnen Zelle Injektionen von viralen GFP. Als ein Proof of Concept zeigen wir, dass wir Photoconvert einzelner Zellen in ein Ganglion im peripheren Nervensystem und Photoconvert größere Populationen wie Zellen befindet sich auf der Bauchseite des Rückenmarks9,10können, 11,12. Wir können diese Photoconverted-Zell-Populationen 24 h später dann visualisieren, um Einblick in ihre Bewegung und Differenzierung während der Entwicklung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In komplexen Gewebe organisieren verschiedene Zelltypen in bestimmten Domänen. Vor kurzem wurden Techniken zur Bezeichnung einzelner Zellen innerhalb dieser großen Gewebe Strukturen1,2,3genutzt. Hier zeigen wir zwei Techniken, die in ähnlicher Weise genutzt werden können, um einzelne Zelle Interaktionen und Zelle Bevölkerung Wechselwirkungen in komplexen Gewebe sichtbar zu machen. Der Vorteil der Ladungszustand Technik ist …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Bernard Kulemaka und Mitglieder des Smith-Lab für ihre hilfreichen Kommentare und Reagenz Beratung, Sam Connell und Brent Redford von 3i für fielding Bildgebung Fragen und Deborah Bang, Karen Heed und Kay Stewart für Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde von der University of Notre Dame, die Elisabeth und Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Zentrum für Zebrafisch-Forschung an der University of Notre und Zentrum von Stammzellen und Regenerationsmedizin an der University of Notre unterstützt. Dame. Alle tierexperimentellen Studien erfolgten in Übereinstimmung mit der University of Notre Dame IACUC Dr. Cody Smith.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
