인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

1. 시 약 설치 셀 동기화에 사용 하는 시 약 2.5 m m 티 미 딘을 포함 하는 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)를 생성 하려면 125 m m 티 미 딘 준비 조직 문화 학년 물 1 mL 당 티 미 딘의 30.28 mg을 디졸브. 여과 0.22 μ m 주사기 필터 장치 솔루션. DMEM 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보완의 50 mL 당 갓된 125 m m 티 미 딘 1 mL를 추가 합니다. Nocodazole의 0.1 μ g/mL를 포함 된 DMEM을 생성 하기 위해 디 메 틸 sulfoxide 5 μ g/μ nocodazole 준비를 (DMSO)에 nocodazole 분해. 추가 5 µ g의 1 µ L / µ L nocodazole DMEM의 50 mL 당 10% (vol/vol) FBS 보충. DMEM 포함 된 DMSO의 0.002% (vol/vol)를 생성 하려면 DMEM 10% (vol/vol) FBS와 보충의 50 mL 당 DMSO의 1 µ L를 추가 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 사용 시 약 세포의 용 해 버퍼 a: 150 m m NaCl, 20 mM Tris HCl (pH 7.4) 준비 및 0.5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). 4 ° c.에 시 약 저장 아세테이트 버퍼 x 5를 준비: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic 산 (HEPES)-코 (pH 7.8), 500mm 칼륨 아세테이트 및 20 m m MgCl2. 실 온에서 시 약 저장. 워시 버퍼 1: 1 x 아세테이트 버퍼, 글리세롤 10% (vol/vol), 0.1% (vol/vol) 트라이 톤 X-100 0.06 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일, ethylenediamenetetraacetic 산 (EDTA) 준비-무료. 사용의 일 또는 사용 하기 전에 하루에 워시 버퍼 1을 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장 AGC 솔루션 준비: 아세테이트 버퍼, 10% (vol/vol) 글리세롤과 0.02% (wt/vol) 3 [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio x 1]-1-propanesulfonat (챕). 4 ° c.에 시 약 저장 2mm CaCl2를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면 1 M CaCl2 AGC 솔루션 50 mL 당 100 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장 3mm 에틸렌 글리콜 bis (b-aminoethylether)를 포함 하는 AGC 솔루션을 생성 하려면-N, N, N’, N’-tetraacetic 산 (EGTA), AGC 솔루션 50 mL 당 0.4 M EGTA (pH 7.5)의 375 µ L 추가. 4 ° c.에 시 약 저장 워시 버퍼 2: 1 x 아세테이트 버퍼와 0.02% (wt/vol) 챕 준비 합니다. 4 ° c.에 시 약 저장 HMD 솔루션 준비: 0.2 M HEPES-코 (pH 7.8), 40 m m MgCl2 와 2 mM dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 시 약 저장참고: HMD 솔루션 3 개월에서 이상 갱신 수 한다. 가수분해 K 버퍼 x 2 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7.6), 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS). -20 ° c.에 시 약 저장 버퍼를 로드 x 2 준비: 95% (vol/vol) formamide, 20 mM EDTA와 1% (wt/vol) 오렌지 G. 저장-20 ° c.에 시 약 2입니다. HeLa 세포의 준비 참고: 준비 HeLa 세포 mitotic 단계 (조작) 또는 비동기적으로 나누어 동기화 (unmanipulated). 37 ° c.에 5% CO2 의 셀 문화 헬러 세포 유사 분열에서의 동기화 플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께. 이틀 후 도금, 2.5 m m 티 미 딘 및 10% (vol/vol) FBS DMEM의 10 mL 매체를 바꿉니다. 24 h에 대 한 셀을 문화. 세 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) (-)의 10 mL로 세포 세척 하 고 10% (vol/vol) FBS 6 h에 대 한 포함 된 DMEM의 10 mL로 세포 문화. Nocodazole의 10% (vol/vol) FBS, 0.1 µ g/mL를 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화. 부드럽게, 문화 접시를 흔들어 하 고 분리 mitotic 세포를 포함 하는 상쾌한을 검색 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다. 원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다 Unmanipulated HeLa 세포의 준비 플레이트 1 x 106 헬 라 세포의 10% (vol/vol) 10 cm 배양 접시에서 FBS 보충 DMEM의 10 mL와 함께. 도금, 후에 2 일 10 mL의 10% (vol/vol) FBS 포함 된 DMEM 매체를 바꿉니다. 문화 30 h 세포. 0.002% (vol/vol) DMSO 10% (vol/vol) FBS, 포함 된 DMEM의 10 mL와 매체를 대체 하 고 14 h에 대 한 셀을 문화. Trypsinization 1 mM EDTA를 포함 하는 트립 신 (2.5 g/L)의 0.7 mL을 사용 하 여 셀을 수집 합니다. IP RdRP 분석 결과 대 한 셀 수를 계산 합니다. 원심에서 4 ° C에서 5 분 동안 490 x g 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.참고: 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장 될 수 있다 3. IP RdRP 분석 결과 단백질 A agarose 구슬 준비 Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 선호도 수 지의 1 mL (침대 볼륨 500 µ L)를 전송. 4 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. 구슬, 하의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 (총 세 세척)를 반복 합니다. 구슬에의 세포의 용 해 버퍼 A 800 µ L를 추가, 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 회전 통에 4 ° C에서 튜브 하룻밤 (또는 적어도 4 h) 회전 합니다. 4 ° C에서 3 분 동안 800 x g 에서 튜브 원심 그리고 삭제는 상쾌한. 구슬에 세포의 용 해 버퍼 A의 500 µ L을 추가 하 고 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합. 4 ° c.에 구슬 저장 세포 lysate의 준비 (선택 사항) 셀 2 단계에서 고정 되어 셀 느슨하게 될 때까지 얼음에 냉동된 세포를 녹여 놓고. 셀 10 mL의 PBS (-)을 한 번 씻어. 1450 x g 4 ° C에서 5 분에 샘플 원심 그리고 삭제는 상쾌한. 부드러운 pipetting으로 얼음 세포의 용 해 버퍼의 세포의 용 해 버퍼 A 1 x 107 셀의 당 (1 mL)으로 세포를 lyse. 다음 조건; 1.5 mL 튜브에 샘플을 sonicate 25%는 sonicator의 증폭을 설정 하 고 10 sonicate s. 4 ° c.에 15 분 동안 20400 x g 에서 샘플을 원심 상쾌한을 수집 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의 1 mL를 각각을 전송 합니다.주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다. Immunoprecipitation 사전 취소 단계의 3.2.6 lysate 40 µ L (구슬 볼륨 20 µ L)를 추가 하 여은 lysate의 1 mL 당 prewashed 단백질 A agarose 구슬의. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 30 분에서 4 ° c.에 대 한 샘플을 회전 13000 x g 4 ° C에서 1 분 동안에 샘플 원심 고 복구는 상쾌한. 40 µ (침대 볼륨 20 µ L) L prewashed 단백질 A agarose 구슬 및 안티 인간 TERT 항 체의 10 µ g의 추가 (복제: 10E9-2)8 에 사전 허가 lysate. 여러 번 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 밤에 4 ° C에서 샘플을 회전. 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 워시 워시 버퍼 1 구슬: 구슬에 워시 버퍼 1의 1 mL을 추가, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 및 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 3 추가 시간이이 단계를 반복 합니다. AGC 솔루션 2mm CaCl2를 포함 하는 구슬 한번 세척: AGC 솔루션 2mm CaCl2 구슬에 포함 된의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. Micrococcal nuclease (MNase)와 구슬 치료: 표 1에 설명 된 MNase 반응 혼합물을 준비. 부드러운 pipetting으로 구슬 MNase 반응 혼합물의 60 µ L에서 resuspend. 흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 25 ° c.에 15 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에참고: 기복이 셰이 커를 사용 하 여이 단계에서 속도 제한에 따라 엄격 하 게 매우 중요 하다. 동영상, 회전 믹서 등의 다른 유형을 권장 하지 않습니다. 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 구슬 3mm EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션 두 번 세척: 구슬 3 m m EGTA를 포함 하는 AGC 솔루션의 1 mL를 추가 하 고, 튜브, 반전 하 여 잘 섞어 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 일단이 단계를 반복 합니다. 워시 워시 버퍼 2 한번 구슬: 워시 버퍼 2의 1 mL를 추가구슬, 튜브, 반전 하 여 잘 혼합 하 4 ° c.에서 5 분에 대 한 샘플을 회전 3300 x g 4 ° C에서 0.5 분에서 샘플 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. RdRP 반응을 설정 하는 동안 얼음에 비즈를 유지.주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다. RdRP 반응 표 2에 설명 된 대로 새로운 튜브에서 RdRP 반응 혼합물을 준비 합니다. [Α-32P]의 6 µ L 추가 UTP (3000 Ci/mmol) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합.참고: [α-32P] ATP, [α-32P] CTP, 또는 [α-32P] GTP [α-32P] 대신 반응에 사용 될 수 있다 광섬유. 템플릿 RNA의 1 µ L를 추가 (1 µ g / µ L) 혼합물을 pipetting으로 잘 혼합.참고: 설정 하려면 RdRP 분석 결과, 다음 RNA 서식 파일 것이 좋습니다: 5′-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3′ 9. 단계의 3.4.3 RdRP 반응 혼합물의 20 µ L와 구슬 pipetting으로 resuspend. 흔들어 샘플 부드럽게 (20 ~ 25 rpm) 32 ° c.에 2 h 형 peltier 인큐베이터에 셰이 커의 턴테이블에 가수분해 K (20 mg/mL)의 5.4 µ L과 2 x 가수분해 K 버퍼의 45.4 µ L 반응 혼합물에 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 Peltier 형 인큐베이터에 턴테이블에 샘플 (20 ~ 25 rpm)를 흔들어 샘플에 RNase 무료 물 109.2 µ L를 추가 합니다. 샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 하 고 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플을 다음 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송. 일단이 단계를 반복 합니다. 20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트의 추가 (pH = 5.2), 4 강 수 캐리어와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 µ L. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한. -20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조.주의: RNase 무료 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.참고: 단계 3.4.11에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안. RNase 처리 RNase 무료 물 단계 3.4.11에서 20 µ L에서 펠 릿 resuspend 표 3에 설명 된 대로 새로운 튜브에 RNase 반응 혼합물을 준비 합니다. 샘플, RNase 반응 혼합물의 180 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 2 h에 대 한 튜브를 품 어 샘플을 10% (vol/vol) SDS의 2.3 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어 샘플을 가수분해 K (20 mg/mL)의 2 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어 샘플에 산 페 놀-클로 프롬의 205 µ L를 추가 합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합 후 실 온에서 5 분 21100 x g 에서 샘플 원심. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송. 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2), 강 수의 4 µ L와 수성 단계에 에탄올의 250 µ L의 20 µ L를 추가 합니다. 잘,에 대 한 튜브를 흔들어 다음 4 ° c.에 20 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 폐기는 상쾌한. -20 ° c.에 저장 된 차가운 70% (vol/vol) 에탄올의 300 µ L와 펠 릿을 세척 4 ° c.에서 15 분 21100 x g 에서 샘플을 원심 삭제는 상쾌한 고 펠 릿 건조.참고: 단계 3.5.9에서에서 펠 릿 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 2 일 동안. 젤 전기 이동 법 그리고 autoradiography RNase 무료 물 20 µ L와 샘플 resuspend 버퍼를 로드 x 2의 20 µ L를 추가 합니다. 95 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 끓여 얼음에 샘플을 짝사랑. 젤을 실행 합니다. 서식 파일 크기 34 국세청 (단계 3.4.3 참조) 경우, 7 M 요소-10 %polyacrylamide 젤 젤 전기 이동 법을 변성 시키기 위해 사용 된다. 젤 젤 건조 기 건조. x-레이 카세트-80 ° c.에 강화 화면 내에서 건조 젤을 영화 노출