Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için
Summary
Bu protokol için baculovirus baculovirus plazmid geçici transfection Sf9 hücreleri tarafından üretilen ve bir serum serbest süspansiyon kültürde güçlendirilmiş. Süpernatant heparin benzeşme Kromatografi tarafından saf ve ultrasantrifüj tarafından daha da yoğunlaştı. Bu iletişim kuralı üretim ve baculovirus gen terapisi uygulama için arıtma için yararlıdır.
Abstract
Baculovirus geleneksel olarak rekombinant protein ve aşı üretimi için kullanılmıştır. Ancak, son zamanlarda, baculovirus gen terapisi uygulama için umut verici bir vektör olarak ortaya çıkıyor. Burada, baculovirus bir yapisan Sf9 hücre kültüründe baculovirus plazmid DNA (bacmid) geçici transfection tarafından üretilir. İstenen ses elde edilir kadar Baculovirus daha sonra serum serbest süspansiyon kültür Sf9 hücrelerde genişletilir. Sonra kültür heparin benzeşme Kromatografi kullanarak süpernatant saf. Virüs süpernatant glikoprotein baculovirus örtmek için baculovirus parçacıklar süpernatant heparin yakınlık nedeniyle içinde bağlar heparin sütun yüklenir. Sütun kirletici kaldırmak için bir tampon ile yıkanır ve baculovirus ile bir yüksek-tuz arabellek sütundan eluted. Eluate izotonik bir tuz konsantrasyonu seyreltilmiş ve baculovirus parçacıkları daha fazla ultrasantrifüj kullanarak yoğunlaşmıştır. Bu yöntemi kullanarak, baculovirus bulaşıcı parçacıklar % 25 kurtarma ile ilâ 500-fold konsantre olabilir. Burada açıklanan protokol 1 L kültürlerden üretim ve baculovirus arınma gösterir rağmen yönteminin ölçekli-klinik-grade vektör gen terapisi uygulama için üretmek için bir kapalı sistem süspansiyon kültür up.
Introduction
Baculovirus öncelikle rekombinant proteinler ve Lepidoptera Spodoptera fugiperda (Sf) 9 aşı üretimi için kullanılan rekombinant Autographa californica multicapsid nükleer polyhedrosis virüs (AcMNPV) kullanarak böcek hücreleri 1 , 2 , 3 , 4. son zamanlarda, gen terapisi uygulama5için umut verici bir vektör olarak ortaya çıkıyor. Bu geniş bir ev sahibi ve doku tropism sahip olduğu bilinmektedir, durgun ve Proliferasyona hücreleri bozar patojenik olmayan ve ana bilgisayar kromozom4,5,6entegre değil. Ayrıca, ölçeklenebilir ve kapalı sistem için gelecekteki klinik üretim1işlemek sağlar süspansiyon serum serbest kültür baculovirus üretilebilir.
Baculovirus parçacıklar saflığı sitotoksisite7,8,9en aza indirirken etkili iletim ulaşmak için önemlidir. Baculovirus ultrasantrifüj veya teğet akışı filtrasyon (TFF) onun infektivite üzerinde sınırlı etkisi ile konsantre. Ancak, bu işlemler sadece virüs parçacıkları konsantre aynı zamanda hücre artıkları ve proteinlerin Sf9 gelen Kültür, hangi-ebilmek var olmak zehirli vitro (kişisel gözlem) ve iltihap veya bir bağışıklık kullanıldığında yanıt neden olabilir vivo içinde. Bu, özellikle yüksek kullanarak virüs stokları konsantre önlemek için bulaşıcı baculovirus saflaştırılmış ve parçacıklar kirletici ayrılmış gerekir.
Birkaç yöntem arıtma ve toplama baculovirus vektörler10,11,12için rapor edilmiştir. Kullanılabilir yaklaşımlar, heparin benzeşme Kromatografi tek adımlı bir üst düzey arıtma proteinler12kirletici düşük konsantrasyon ile sağlar. Yönteminin kimliği heparan sülfat ile reseptör baculovirus13,14dayanmaktadır. Sf9 hücre süpernatant üstüne belgili tanımlık sütun ve baculovirus bağlama yükledikten sonra sütun ilişkisiz veya gevşek bağlı bulaşıcı parçacıkları kaldırmak için fizyolojik (izotonik) arabellek ile yıkanabilir. Heparin bağlama tersinir olduğundan, baculovirus parçacıklar hemen inactivation önlemek için fizyolojik (izotonik) tuz konsantrasyonu için ozmotik şok12ile seyreltilmiş yüksek bir salt arabellek ile eluted. Ayrıca, üretim baculovirus yanı sıra üzerinde yakalama ve elüsyon Kromatografi sütundan yapılabilir mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) ile uyumlu olan bir kapalı sistem işlemi kullanarak.
Burada, biz üretim, arıtma ve bulaşıcı baculovirus benzeşme Kromatografi ve Santrifüjü kullanarak konsantrasyon için detaylı bir protokol sağlar. Kısaca, baculovirus ile transfection Sf9 hücre yapisan kültür baculovirus plazmid DNA ile üretmek ve daha fazla serum serbest süspansiyon kültürü bulaşıcı baculovirus genişletin. Heparin benzeşme Kromatografi kullanarak baculovirus arındırmak ve ultrasantrifüj vektör gen terapisi uygulama için son derece konsantre için son adım olarak kullanın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan Protokolü baculovirus süspansiyon kültür Sf9 hücrelerde üretimi ve heparin benzeşme Kromatografi kullanarak baculovirus arınma açıklar. Bu protokol için kullanılan parametreler verimi en üst düzeye çıkarmak ve bulaşıcı baculovirus inactivation en aza indirmek. Burada sağlanan iletişim kuralı baculovirus parçacıklar iyileşme ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde geliştirilmiş bir kurtarma başkaları tarafından9elde gösterir.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen başlangıç Cincinnati çocuk Araştırma Vakfı (CCRF) üzerinden M.N. ve yenilikçi çekirdek Grant (ICG) ulusal sağlık Enstitüleri altında ilerleyen translasyonel Bilimler için Ulusal Merkezi tarafından desteklenen için finansman tarafından desteklenen Ödülü sayı UL1 TR001425. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
