Ex Vivo Infektion af menneskelige lymfoide væv og kvindelige kønsorganer slimhinde med Human immundefekt Virus 1 og Histoculture
Summary
Infektion med humant væv med human immundefekt virus (HIV) ex vivo giver en værdifuld 3D model af virus patogenese. Her, beskriver vi en protokol for at behandle og inficere væv prøver fra menneskelige tonsiller og kvindelige kønsorganer mucosae med HIV-1 og fastholde dem i kultur på grænsefladen væske-luft.
Abstract
Histocultures giver mulighed for at studere intercellulære interaktioner inden for humane væv, og de kan blive ansat til model vært-patogen interaktioner under kontrollerede laboratorieforhold. Ex vivo infektion af væv med human immundefekt virus (HIV), blandt andre vira, har held været anvendt til at undersøge tidlig sygdom patogenese, samt en platform til at teste effekten og toksicitet af antivirale lægemidler. I denne protokol forklare vi, hvordan til at behandle og smitte med HIV-1 væv explants fra menneskelige tonsiller og cervikal mucosae, og bevare dem i kultur på toppen af gelatine svampe på grænsefladen væske-luft for omkring to uger. Indstillingen ikke-polariseret kultur maksimerer adgang til næringsstoffer i substratet og ilt, selv om fremadskridende tab af væv integritet og funktionelle arkitekturer er dens vigtigste begrænsning. Denne metode giver mulighed for overvågning af HIV-1 replikation og patogenesen ved hjælp af flere teknikker, herunder immunassays, qPCR og flowcytometri. Af betydning, kan fysiologisk variabiliteten mellem væv donorer samt mellem explants fra forskellige områder af det samme prøvemateriale, påvirke eksperimentelle resultater. For at sikre resultatet reproducerbarhed, det er afgørende for at bruge et passende antal explants, tekniske replikater og donor-matchede kontrol betingelser til at normalisere resultater af de eksperimentelle behandlinger, når indsamling af data fra flere eksperimenter (dvs. ., gennemføres ved hjælp af væv fra forskellige donorer) til statistiske analyser.
Introduction
Monotypisk bi-dimensionel cellekulturer, her henvises til som konventionelle, ikke højde for fysisk og funktionel kommunikationen mellem en lang række celletyper, at komponerer væv og organer. Dette aspekt er af afgørende betydning for eksperimentelle modeller af sygdommen, som interferens med homeostatiske intercellulære interaktioner er den drivende faktor af alle patologier. Væv explants tilbyder store fordele for modellering sundhed og sygdom i mennesker, fordi de bevarer cytoarchitecture og mange vigtige funktionelle aspekter af organer, som de er i vivo, men for en begrænset mængde tid1. For eksempel, på ex vivo udfordring med recall antigener, såsom difteri toxoid eller tetanustoksoid, reagerer tonsillar væv med en kraftig produktion af antigen-specifikke antistoffer2. Ligesom enhver anden ex vivo model, histoculture har sine egne begrænsninger: Inter donor variabilitet, væv polarisering, begrænset væv overlevelse og vanskeligheder i overvågning celler ud over dybden af konfokalmikroskopi1. Humant væv explants er dog fortsat en model af valg at studere homeostatiske og patogene immunologiske processer hos mennesker, herunder vært-patogen interaktioner og potentielle terapeutiske indgreb3.
De kritiske begivenheder af HIV-1 patogenese finder sted i væv. Infektion af genital slimhinden tegner sig for størstedelen af alle HIV-1 transmission begivenheder worldwide4. Lymfoide væv er den største site af virus replikering under akut infektion og havne en stor pulje af latent inficerede celler5, og deres persistens repræsenterer den vigtigste hindring for at opnå en kur6. Kultur og ex vivo udfordringen at menneskelige lymfoide og slimhinden væv giver nogle fordele i forhold til konventionelle systemer baseret på isolerede celler for studier af HIV-1. For eksempel, kan væv-resident celler støtte HIV-1 infektion i mangel af eksogene aktivering, i stedet for perifert blod mononukleære celler1. Den lymfoide væv explants har tilladt en bedre forståelse af nogle vigtige mekanismer bag CD4 T celle nedbrydningendet vil sige, tilskuer effekt7, som er kendetegnende for akut infektion. Bevarelse af strukturer som B-celle follikler i lymfoide væv8 og epitel i kvindelige kønsorganer mucosa explants9 tilbyder en unik mulighed for at integrere fysisk og funktionel funktioner af HIV-1 infektion på disse websteder. Endelig, histocultures blev med succes brugt til model og studere HIV-1 og herpesvirus Co infektion10,11, samt for præklinisk afprøvning af antiretrovirale lægemidler og multitarget mikrobicider12, 13 , 14 , 15.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for kulturen i humant væv explants fremstillet af mandler og slimhinden væv fra den nedre kvindelige kønsorganer (livmoderhalsen), der dækker væv dissektion at explant udfordring med HIV-1 i en ikke-polariseret måde. Kulturen af væv explants på væske-luft grænseflade, ved hjælp af gelatine svampe som en støtte, maksimerer eksponering til air ilt samtidig give adgang til næringssubstratet næringsstoffer gennem svampen kapillærer, således at forskyde deres naturlige forfald. Den mest umiddelbare måde i vurderingen af HIV-1 replikation i vores system er at måle mængden af virus udgivet i dyrkningsmediet eksplantat over tid af immunassay eller qPCR. HIV-1 infektion og patogenese (fx., CD4 T celle nedbrydningen) kan også vurderes i væv explants af bulk RNA/DNA-ekstraktion og qPCR, i situ farvning eller enkelt celle-analyse på væv fordøjelsen ved flowcytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brugen af menneskelige væv explants for undersøgelsen af HIV-1 infektion giver fordele frem for traditionelle bi-dimensionel og monotypisk eksperimentelle systemer, såsom primærelementer eller cellelinjer, grund af deres overlegne evne til at reproducere intercellulære interaktioner og cellulære funktioner (f.eks.cytokin produktion) som de er i vivo. Ikke desto mindre tonsillar og cervikal væv er forskellige i mange aspekter, herunder antallet og fænotypiske og funktionelle egenskaber af HIV tar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra fonden Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Foundation svenske læger mod AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) og Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) til Andrea Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
