לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture
Summary
דלקת של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ex-vivo מספק דגם תלת-ממד חשוב של וירוס פתוגנזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעבד, להדביק דגימות רקמות מן האדם את השקדים mucosae באברי המין הנשי עם HIV-1 ולשמור אותם בתרבות-הממשק נוזלי-אייר.
Abstract
Histocultures אפשר ללמוד אינטראקציות המערכת בתוך רקמות אנושיות, הם יכול להיות מועסק כדי דגם אינטראקציות פתוגן-פונדקאי בתנאי מעבדה מבוקרת. Ex-vivo זיהום של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), בין וירוסים אחרים, שימש בהצלחה לחקור מוקדם בפתוגנזה של המחלה, כמו גם פלטפורמה כדי לבדוק את יעילות ורעילות של תרופות אנטי. בפרוטוקול הנוכחי, נסביר כיצד לעבד, להדביק עם HIV-1 explants רקמת השקדים אנושי, mucosae צוואר הרחם וכן לשמור על אותם בתרבות מעל ג’לטין ספוגים-הממשק נוזלי-אייר למשך שבועיים בערך. הגדרה זו תרבות שאינם מקוטב הגדלת גישה המזינים תרבות בינונית, חמצן, למרות אובדן הדרגתי של רקמות תקינות וארכיטקטורות פונקציונלי נשאר הגבלה הראשי שלה. שיטה זו מאפשרת פיקוח על שכפול HIV-1 ו פתוגנזה בעזרת מספר טכניקות, כולל immunoassays, qPCR של cytometry זרימה. חשיבות, ההשתנות הפיזיולוגיות בין רקמות תורמים, ובין explants מאזורים שונים של הדגימה זהה, עלול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניסוי. כדי להבטיח תוצאה הפארמצבטית, זה קריטי להשתמש מספר explants, משכפל טכני והתנאים מתאימים התורם שליטה לנרמל את התוצאות של טיפולים ניסיוניים בעת הידור נתונים ניסויים מרובים (כלומר ., מתנהל באמצעות רקמות מתורמים שונים) לשם ניתוח סטטיסטי.
Introduction
תרביות תאים דו מימדית סוג, התייחס כאן כמו קונבנציונאלי, לא חשבון התקשורת המרחבית ופונקציונליים בין מגוון גדול של סוגי תאים שמרכיבים רקמות ואיברים. היבט זה הוא בחשיבות עליונה עבור גרסאות ניסיוניות של מחלות, כמו הפרעה homeostatic אינטראקציות המערכת היא הגורם המניע של כל פתולוגיות. רקמת explants מציעים יתרונות חשובים עבור מידול בריאות ומחלות בבני כי הם שומרים את cytoarchitecture והיבטים רבים חשוב פונקציונלי של איברים כמו הם ויוו, למרות כמות מוגבלת של זמן1. לדוגמה, בעת שמחוץ אתגר עם אנטיגנים האחזור, כגון דיפתריה טוקסואידי או טטנוס טוקסואידי, רקמת השקדים מגיב עם הפקה נמרצת של אנטיגן ספציפי נוגדנים2. כמו שמחוץ מודל אחר, histoculture יש מגבלות משלו: התורם בין השתנות, קיטוב רקמות, רקמות מוגבל הישרדות, הקושי ניטור תאי מעבר עומק מיקרוסקופיה קונפוקלית1. למרות זאת, רקמה אנושית explants נשארים מודל של הבחירה ללמוד תהליכים אימונולוגי homeostatic פתוגניים בבני אדם, כולל אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, התערבויות טיפוליות אפשריות3.
האירועים הקריטיים של פתוגנזה HIV-1 מתקיימים ברקמות. דלקת של רירית איברי המין חשבונות עבור הרוב המכריע של כל HIV-1 שידור אירועים ברחבי העולם4. רקמות הלימפה נמצא האתר העיקרי של וירוס שכפול במהלך זיהום אקוטי בנמלים מאגר משמעותי של תאים הנגועים לחשוף5ו ההתמדה שלהם מייצג את המכשול העיקרי להשגת התרופה6. האתגר תרבות, ex-vivo של רקמות הלימפה ואת הרירית לספק כמה יתרונות לעומת מערכות קונבנציונאלי המבוסס על תאים מבודדים עבור המחקר של HIV-1. למשל, שוכנת רקמת תאים יכול לתמוך זיהום ב- HIV-1 בהיעדרו של הפעלה אקסוגני, לעומת תאי תאי דם היקפיים1. השימוש של רקמת הלימפה explants אפשרה הבנה טובה יותר של כמה מנגנונים מרכזיים שבבסיס CD4 T תא דלדולכלומר, אפקט הצופה מהצד7, וזה סימן ההיכר של דלקת חריפה. שימור מבנים כמו תא B זקיקי הלימפה ברקמות8 ו האפיתל רירית איברי המין הנשי explants9 מציע הזדמנות ייחודית לשלב תכונות המרחבי פונקציונלי של זיהום ב- HIV-1 באתרים אלה. לבסוף, histocultures שימשו בהצלחה מודל המחקר HIV-1 וההרפס ושיתוף הידבקות10,11, כמו גם לניסויים פרה של antiretrovirals ו multitarget microbicides12, 13 , 14 , 15.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור התרבות של רקמה אנושית explants המתקבל השקדים ורקמות הרירית מ נמוך יותר בדרכי המין הנשי (צוואר הרחם), כיסוי לנתיחה רקמות כדי explant אתגר עם HIV-1 בדרך הלא מקוטב. התרבות של רקמת explants-הממשק אוויר נוזלי, בעזרת ג’לטין ספוגים כמשענת, הגדלת החשיפה מהאוויר חמצן תוך מתן גישה תרבות בינוני חומרים מזינים באמצעות הספוג נימים, ובכך לעכב את הריקבון הטבעי שלהם. הדרך המיידית ביותר להערכת שכפול HIV-1 במערכת שלנו היא למדוד את כמות וירוס שפורסם המדיום תרבות explant לאורך זמן על-ידי מתכלה או qPCR. זיהום ב- HIV-1, פתוגנזה (למשל., דלדול תאי CD4 T) גם ניתן להעריך רקמת explants על-ידי בצובר מיצוי RNA/DNA ו- qPCR, בחיי עיר מכתים או תא בודד-אנליזה על עיכול רקמת מאת cytometry זרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש של רקמה אנושית explants עבור המחקר להידבקות ב- HIV-1 מספק יתרונות על פני המסורתית דו מימדית סוג ניסיוני ומערכות, כגון ראשי תאים או שורות תאים, בשל יכולתם מעולה לשחזור המערכת אינטראקציות ו סלולרי מתפקד (למשל, ייצור ציטוקינים) כפי שהם ויוו. למרות זאת, רקמת השקדים ואת צוואר הרחם שוני?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים בילדט לבית של קרן Blanceflor Boncompagni לודוויזי (http://blanceflor.se/), הרופאים שבדי קרן נגד איידס (http://www.aidsfond.se/, הפניה למעורר FOa2014-0006), ו- e דל’אנג’לו אנדריאה Lorini ליבי (http : / / fondazionelorini.it/) כדי אנדראה Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
