Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture
Summary
Infecção de tecidos humanos com vírus de imunodeficiência humana (HIV) ex vivo fornece um valioso modelo 3D da patogênese do vírus. Aqui, descrevemos um protocolo para processar e infectar amostras de tecido da amígdalas humanas e mucosa genital feminina com HIV-1 e mantê-las em cultura em uma interface líquido-ar.
Abstract
Histocultures permitem estudar interações intercelulares nos tecidos humanos, e eles podem ser empregados para interações patógeno-hospedeiro de modelo sob condições controladas de laboratório. Infecção ex vivo de tecidos humanos com vírus da imunodeficiência humana (HIV), entre outros vírus, tem sido utilizada com sucesso para investigar a patogênese precoce de doença, bem como uma plataforma para testar a eficácia e a toxicidade de medicamentos antivirais. No presente protocolo, vamos explicar como processar e infectar com o HIV-1 explantes de tecido humanas amígdalas e mucosa cervical e mantê-las em cultura em cima de esponjas de gelatina em uma interface líquido-ar por duas semanas. Esta definição de cultura não-polarizado maximiza o acesso aos nutrientes em meio de cultura e de oxigénio, embora progressiva perda da integridade do tecido e arquiteturas funcionais continua a ser sua principal limitação. Este método permite monitorar a replicação do HIV-1 e patogênese usando várias técnicas, incluindo os imunoensaios qPCR e citometria de fluxo. De importância, a variabilidade fisiológica entre doadores de tecidos, bem como entre explantes de áreas diferentes da mesma amostra, pode afetar significativamente os resultados experimentais. Para garantir a reprodutibilidade do resultado, é fundamental usar um número adequado de explantes, repetições de técnicas e condições de controle de doador compatível para normalizar os resultados dos tratamentos experimentais quando compilando dados de experimentos múltiplos (por exemplo ., conduzido usando tecidos de doadores diferentes) para análise estatística.
Introduction
Culturas de células bi-dimensional monotípico, aqui referidas como convencional, não em conta a comunicação funcional e espacial entre a grande variedade de tipos de células que compõem os tecidos e órgãos. Este aspecto é de suma importância para modelos experimentais da doença, como interferência com interações intercelulares homeostáticas é o fator determinante de todas as patologias. Explantes de tecido oferecem grandes vantagens para a modelagem de saúde e doença em seres humanos porque retêm o cytoarchitecture e muitos importantes aspectos funcionais dos órgãos, como eles estão em vivo, apesar de uma quantidade limitada de tempo1. Por exemplo, sobre o desafio de ex vivo com antígenos de recordação, como toxoides da difteria ou toxoide tetânico, tecido tonsilar responde com uma vigorosa produção de anticorpos antígeno-específicos2. Como qualquer outro ex vivo modelo, histoculture tem suas próprias limitações: variabilidade inter doador, polarização de tecido, sobrevivência de tecido limitada e dificuldade no acompanhamento células além da profundidade da microscopia confocal1. Não obstante, explantes de tecido humano continuam a ser um modelo de escolha para estudar processos imunológicos homeostáticos e patogênicos em humanos, incluindo interações patógeno-hospedeiro e possíveis intervenções terapêuticas3.
Os eventos críticos de patogênese do HIV-1 realizam-se nos tecidos. Infecção da mucosa genital é responsável pela maioria de todos os HIV-1 transmissão eventos em todo o mundo4. Tecido linfoide é o maior site de replicação de vírus durante a infecção aguda e abriga uma piscina significativa de células Latentemente infectadas5, e sua persistência constitui o principal obstáculo para alcançar uma cura6. O desafio de cultura e ex vivo dos tecidos linfoides e mucosa humanos oferecem algumas vantagens sobre os sistemas convencionais baseados em células isoladas para o estudo do HIV-1. Por exemplo, células do tecido-residente podem oferecer suporte a infecção HIV-1 na ausência de ativação exógena, ao contrário de células mononucleares de sangue periférico1. A utilização de tecido linfoide explantes permitiu uma melhor compreensão de alguns mecanismos chaves subjacentes T CD4 celular depleçãoou seja, o espectador efeito7, qual é a marca da infecção aguda. A preservação de estruturas como folículos de células B no tecido linfoide8 e o epitélio na mucosa genital feminina explantes9 oferece a oportunidade única de integrar características espaciais e funcionais da infecção de HIV-1 nesses locais. Finalmente, histocultures foram usados com sucesso para o modelo e estudo de10,co-infecção HIV-1 e herpesvírus11, bem como para testes pré-clínicos de anti-retrovirais e multitarget microbicidas12, 13 , 14 , 15.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura do tecido humano explantes obtidos de amígdalas e tecido da mucosa do trato genital feminino inferior (colo do útero), cobrindo a dissecção de tecidos para explant desafio com HIV-1 em uma maneira não-polarizado. A cultura do tecido de explantes na interface líquido-ar, utilizando esponjas de gelatina como suporte, maximiza a exposição para o oxigênio do ar, proporcionando acesso aos nutrientes do meio de cultura através da esponja capilares, atrasando assim sua deterioração natural. A maneira mais imediata de avaliar a replicação do HIV-1 em nosso sistema é medir a quantidade de vírus lançado em meio de cultura de explant ao longo do tempo por imunoensaio ou qPCR. Infecção de HIV-1 e patogênese (EG., depleção de células T CD4) também pode ser avaliada em explantes de tecido pelo volume de extração de RNA/DNA e qPCR, em situ coloração ou célula única-análise mediante digestão do tecido por citometria de fluxo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A utilização de tecido humano explants para o estudo da infecção por HIV-1 fornece vantagens sobre os tradicionais sistemas experimentais bi-dimensional e a única espécie, tais como as células primárias ou linhas de células, devido a sua superior capacidade de reproduzir interações intercelulares e celular as funções (por exemplo, produção de citocinas) como eles são na vivo. No entanto, o tecido tonsilar e cervical diferem em muitos aspectos, incluindo o número e características fenot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), a Fundação sueca médicos contra a AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) e da Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) para Andrea Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
