Génération de chromatine Genome-wide Conformation Capture bibliothèques d’embryons de drosophile début étroitement mise en scène

1. collecte d’embryons de drosophile Remarque : Une collecte d’embryons équivalent peut être effectuée comme indiqué dans une précédente publication15. Transférer les jeunes eGFP-PCNA mouches (< 1 semaine vieux) dans des cages collection oeuf avec une collection plaques16 (1 % éthanol, acide acétique à 1 % et 4 % d’agar). Déplacer les cages de la collection dans un incubateur à 25 ° C. Une incubation de 1 à 2 jours avant la collecte des œufs améliore de manière significative le rendement de l’oeuf. Changer les plaques collectrices deux fois par jour. Enlever les plaques contenant des embryons de la chambre de collecte en intervalles de 30 à 60 min. Des intervalles entraîner dans des embryons de moins, mais plus stricte répartition des stades de développement. Recueillir auprès des cages multiples en parallèle alors qu’idéalement > 200 œufs sont pondus à chaque 30 à 60 min. Stocker les plaques à 25 ° C jusqu’à ce que les embryons atteignent l’âge désiré. Pour les embryons au stade blastoderme (cycle nucléaire 14), incuber pendant environ 2 h. Après 2 h d’incubation, ajouter l’eau du robinet d’un vaporisateur à la plaque de collection afin que la totalité de la surface est recouverte d’eau. Suspendre les embryons et levure à l’aide d’une brosse douce. Versez resuspendues embryons de la plaque de la collection dans un bac de ramassage de l’embryon (crépines cellule commerciale avec la taille des pores 100 µm ou paniers maison17 fonctionnent bien), ajoutant de l’eau du robinet supplémentaire d’un vaporisateur, si nécessaire. À ce stade, combiner les embryons des boîtes qui ont été recueillis en parallèle. L’échantillon représente un lot unique. Lavez les embryons bien en rinçant le panier avec l’eau du robinet d’un vaporisateur pour 30 s jusqu’à ce que tous les résidus de levure sont emporté. Dechorionate embryons en plaçant le bac de ramassage dans une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5 % dans l’eau. Agitation légère en agitant facilite l’élimination du chorion. Continuer jusqu’à ce que les embryons soient suffisamment hydrophobes afin qu’elles flottent à la surface de la solution lorsque le panier est soulevé et immergé à nouveau, qui devrait prendre la ~1.75–2 min.ATTENTION : l’hypochlorite de Sodium est corrosif. Porter un équipement de protection individuelle approprié. Solutions contenant < 10 % d’hypochlorite de sodium peuvent généralement être éliminés dans l’évier, vérifiez le règlement de l’Institut de l’hôte. Retirer le panier de la solution et rincer abondamment à l’eau du robinet d’un vaporisateur, jusqu’à ce que l’odeur de l’eau de Javel n’est plus perceptible. 2. Fixation de l’embryon Remarque : Des conditions de fixation optimale, principalement la concentration de détergent, de formaldéhyde et de la durée de fixation, doivent être déterminées empiriquement pour s’adapter à la scène des embryons. Pour les étapes autour du blastoderme syncytial, une concentration finale de 0,5 % Triton X-100 et 1,8 % de formaldéhyde dans la phase aqueuse fonctionnent bien. Pour les étapes ultérieures au stade embryon 9, outre l’optimisation de ces paramètres peut être nécessaire. Toutes les solutions utilisées lors de la fixation et le tri doivent contenir des antiprotéases. Inverser le bac de ramassage et placez-le sur un tube de centrifugation conique de 15 mL. Rincer les embryons du panier dans le tube à l’aide d’une pipette Pasteur distribution PBS-T (PBS, 0,5 % Triton X-100). Laissez les embryons s’installer en bas et régler le volume total de 2 mL avec du PBS-T. Ajouter 6 mL d’heptane et 100 µL de 37 % de formaldéhyde dans l’eau.ATTENTION : Heptane et le formaldéhyde sont toxiques lorsqu’ils sont inhalés ou après peau contacter. Porter un équipement de protection individuelle approprié et travailler sous une hotte. Déchets contenant de l’heptane ou formaldéhyde doit être traité séparément, conformément aux règlements de l’Institut de l’hôte. Après l’addition de la formaldéhyde, démarrer une minuterie de 15 min et agiter vigoureusement le tube monte et descend pendant 1 min à la main. La phase aqueuse et organique combinera à consistance forme un shampooing-like. Agiter sur un mélangeur rotatoire jusqu’à 10 min après l’ajout de formaldéhyde. Centrifuger à 500 g pendant 1 min à température ambiante pour recueillir les embryons au fond du tube. Aspirer le liquide comme shampooing entière et jetez-le, prenant soin de ne pas pour aspirer les embryons. Petites quantités restantes de surnageant comme shampooing ne causent pas de problèmes. 15 min après l’ajout de formaldéhyde, remettre en suspension les embryons dans 5 mL de PBS-T avec glycine de 125 mM pour étancher le formaldéhyde. Mélanger vigoureusement en agitant de haut en bas pendant 1 min. Centrifuger à 500 g à température ambiante pendant 1 min et aspirer le surnageant. Lavez les embryons par eux resuspendant dans 5 mL de PBS glacee-T. Laissez les embryons settle et aspirer tout surnageant. Répéter le lavage à l’étape 2.10 deux fois plus. Garder les embryons sur la glace jusqu’au tri. Habituellement, c’est une bonne idée de recueillir 3 – 4 lots d’embryons mouches avant de procéder au tri. Cependant, les embryons doivent être triés le même jour. Un stockage prolongé sur la glace ou dans le réfrigérateur conduit à morphologie altérée embryon. 3. embryon tri NOTE : Tri peut être fait sur n’importe quel microscope stéréo fluorescent équipé d’un filtre GFP au grossissement X 60 – 80. À l’aide d’une pipette 1 000 µL, transférer un lot d’environ 100 embryons dans un récipient de petit verre approprié pour le tri, de préférence d’une couleur foncée et placez-le sur la glace. Embryons de tri par statut nucléaire densité et cycle cellulaire (Figure 1) en poussant les embryons souhaitables dans un tas séparé à l’aide d’une pointe d’aiguille ou une seringue. Supprimer tous les embryons avec distribution dispersée, non-nucléaire d’eGFP-PCNA (Figure 1E). Aussi, les embryons que partiellement montrent un signal GFP non nucléaires doivent être supprimés. Pour faciliter le tri, assembler un line-up d’embryons de référence au cycle nucléaire 12, 13 et 14 dans chaque lot en utilisant comme guide les photos dans la Figure 1 . Utiliser ce line-up pour faire correspondre les embryons d’un stade inconnu avec l’un des embryons référence afin de déterminer leur stade. Pour vérifier le stade de développement pour les embryons de référence, mesurer la densité nucléaire par imagerie de l’embryon et compter le nombre de noyaux à la surface de l’embryon dans une superficie de 2 500 µm2 à l’aide de logiciels d’imagerie qui fournit des informations à distance.Remarque : Le nombre de noyaux pour une superficie de 2 500 µm2 est 12 à 16 noyaux au cycle nucléaire 12 et 20 à 30 noyaux au cycle nucléaire 1313. Une fois que tous les embryons au stade approprié sont séparées, prendre des photos des embryons de documentation et de contrôle de la qualité. Si le microscope stéréo n’est pas lui-même muni d’un module de caméra, un microscope à épifluorescence avec GFP filtres peut être utilisé. Pipetter vers le haut les embryons désirées en utilisant une pipette 1 000 µL, transfert vers un nouveau tube et le lieu sur glace. Continuez jusqu’à ce que suffisamment embryons sont triées pour l’expérience prévue. Pour les embryons âgés que de l’étape 9, généralement 20 embryons sont suffisants pour un in situ l’expérience Hi-C. Au cycle nucléaire 12, 80 embryons sont un bon point de départ. Lors des cycles précédents, le nombre d’embryons doit être pratiquement doublé pour chaque cycle. Piscine et split embryons dans des tubes de 1,5 mL de telle sorte qu’un tube contienne suffisamment embryons pour un seul in situ CIH experiment. Il est conseillé d’utiliser des tubes avec les caractéristiques de la liaison ADN faibles, puisque le même tube sera utilisé pour l’ensemble du protocole et l’adsorption de l’ADN peut conduire à des pertes importantes à de faibles concentrations d’ADN. Tourner les tubes brièvement à 100 g à la température ambiante et éliminer le surnageant. Les embryons devraient être aussi sèches que possible pour la congélation. Flash congeler les embryons en immergeant les tubes dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C. 4. in Situ Salut-C Lyse Placer les tubes avec des embryons congelés sur la glace. Remettre en suspension les embryons dans 500 µL de tampon de lyse glacé (10 mM Tris-Cl pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2 % IGEPAL CA-630, les inhibiteurs de la protéase ; dissous dans l’eau). Ensuite, attendre 1 min pour laisser les embryons à s’installer au fond du tube. Embryons de mouture à l’aide d’un pilon micro métal, préalablement refroidi sur la glace, qui est conçu pour s’adapter étroitement à un tube de microtubes de 1,5 mL. Pour éviter d’agiter les embryons, insérer le pilon lentement jusqu’à ce qu’il touche le fond du tube, poussez vers le bas et puis moudre en tournant le pilon deux fois dans les deux sens. Soulever le pilon très légèrement, pousser jusqu’au fond du tube à nouveau et répéter meulage. 4.1.3.2 le répète 10 fois, ou jusqu’à ce que les embryons sont complètement lysées. La solution doit être homogène et sans gros morceaux résiduels d’embryons doit rester. Incuber la suspension homogénéisée sur la glace pendant 15 min. Spin à 1 000 x g, 4 ° C pendant 5 min et jeter le surnageant. Laver les granulés par resuspendant dans 500 µL de tampon de lyse glacee, pipetage de haut en bas. Tourner de nouveau comme 4.1.4 et jeter le surnageant. Resuspendre lavé culot dans 100 µL de 0,5 % dodécylsulfate de sodium (SDS), pipetage de haut en bas. Permeabilize noyaux en incubant pendant 10 min à 65 ° C dans un bloc chauffant. Étancher SDS en ajoutant 50 µL de 10 % Triton X-100 et 120 µL d’eau. Mélanger en effleurant le tube. Incuber à 37 ° C pendant 15 min dans le bloc chauffant. Enzyme de restriction digestion Ajouter 25 µL d’enzyme de restriction mémoire tampon 10 x et 20 U de 5 U/µL MboI. Mélanger en effleurant le tube. Digérer l’ADN en incubant pendant 90 min à 37 ° C dans le bloc chauffant sous agitation légère (750 tr/min). Ajouter un autre 20 U de MboI et continuer d’incubation pendant 90 min. Chaleur-inactiver MboI en incubant à 62 ° C pendant 20 min. Porte-à-faux Fill-inNOTE : Remplissant le porte-à-faux avec biotinylé dATP permet de sélectionner des fragments ligaturés spécifiques. Biotine-dATP aux intersections de la ligature est protégé contre l’activité exonucléase de T4 ADN polymérase (section 4.6), tandis que la biotine-dATP à extrémités franches unligated est éliminée efficacement. Le menu déroulant utilisant streptavidine perles au point 4.7 donc spécifiquement enrichit de fragments d’ADN ligaturés, chimériques. Ajouter 18 µL de 0,4 mM biotine-14-dATP, 2,25 µL d’un mélange de dCTP/dGTP/dTTP non modifié (3,3 mM) et 8 µL de 5 U/µL ADN polymérase I Fragment de Klenow. Mélanger en effleurant le tube et laisser incuber à 37 ° C pendant 90 min en bloc chauffant. LIGATURE Ajouter 657 µL d’eau, 120 µL de 10 x T4 DNA Ligase tampon, 100 µL de 10 % de X-100 Triton, 6 µL de 20 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et mélanger en effleurant le tube. Enfin ajouter 5 µL de 5 U/µL T4 DNA Ligase et mélanger en effleurant le tube. Tourner tube doucement (20 t/mn) à température ambiante pendant 2 h. Ajouter une deuxième tranche de 5 µL de 5 U/µL T4 DNA Ligase et continuer à tourner pour 2 h de plus. Tournez en bas des noyaux à 2 500 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Extraction d’ADN Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon d’extraction (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM acide tétraacétique (EDTA), 1 % SDS ; dissous dans l’eau) et ajouter 20 µL de protéinase K. Mix de la 20 mg/mL en effleurant le tube. Digérer les protéines en incubant à 55 ° C pendant 30 min, secouant à 1 000 tr/min. De-crosslink, ajouter 130 µL de 5 M de NaCl et incuber une nuit à 68 ° C, secouant à 1 000 tr/min. Échantillon de la pipette dans un nouveau tube de 2 mL, préférentiellement avec faibles caractéristiques de liaison de l’ADN. Ajouter 0,1 x volumes (63 µL) de 3M sodium acétate pH 5,2 et 2 µL de 15 mg/mL GlycoBlue. Bien mélanger en retournant. Ajouter 1,6 x volumes (1 008 µL) d’éthanol absolu pur et mélanger par retournement. Incuber à-80 ° C pendant 15 min. Centrifuger à 20 000 x g à 4 ° C pendant au moins 30 min. Le culot d’ADN est souvent très faible, presque invisible et peut seulement être repéré en raison de la couleur bleue des GlycoBlue. Retirez surnageant très soigneusement, quittant l’embout de la pipette dans le tube le long du mur opposé où se trouve le granule d’ADN. Petites gouttelettes restantes sont souvent faciles à enlever au cours de cette étape et les lavages suivants en les poussant hors les tubes à l’aide d’une pointe de P10 plutôt que les pipetage. Pastille de lavage en ajoutant 800 µL d’éthanol 70 %. Mélanger en retournant et centrifuger à 20 000 x g à température ambiante pendant 5 min. répéter ce lavage au moins une fois. Éliminer toute trace d’éthanol et laissez le reposer tube lorsque le couvercle est ouvert jusqu’à 5 min à sécher à l’air. Une fois qu’aucun liquide n’est restant, ajouter 50 µL de pH 10 mM Tris-Cl 8.0. Pipette à plusieurs reprises la solution sur la zone sur la paroi du tube où se trouvait le culot de solubiliser l’ADN. Ajouter 1 µL de 20 mg/mL RNase A, mélangez en effleurant le tube et incuber à 37 ° C pendant 15 min à digérer RNA. L’échantillon peut maintenant être stocké dans le réfrigérateur pendant la nuit ou congelé à-20 ° C indéfiniment. Vérifier la concentration de l’ADN à un dosage de colorant fluorescent basé selon les instructions du fabricant. Le montant total de l’ADN dans l’échantillon doit être au moins 10 ng, sinon trop peu de matériel est disponible pour l’amplification et complexité de bibliothèque sera probablement faible. Lorsque cela se produit, la quantité de matériel de départ n’était probablement pas suffisante, ou matériel a été perdu en chemin, peut-être lors de la lyse et de précipitations. Enlèvement de la biotine et le cisaillement d’ADN Ajouter ensemble 12 µL de tampon de T4 ADN polymérase x 10, 3 µL de dATP 1 mM, 3 µL de 1 mM dGTP et 46 µL d’eau. Mélanger en effleurant le tube. Ajouter 5 µL de 3 U/mL T4 ADN polymérase, mélanger en effleurant le tube et laisser incuber à 20 ° C pendant 30 min. Ajouter 3 µL de 0,5 M EDTA pour arrêter la réaction et utiliser l’eau pour amener l’échantillon à un volume d’environ 120 µL. Cisaillement de l’ADN d’une taille de 200 – 400 bp à l’aide d’un dispositif de sonication conformément aux instructions du fabricant. Le sonicateur mentionné dans la Table des matières, le programme suivant est approprié : 2 cycles de chacun des 50 s, le droit de 10 %, intensité 5, 200 cycles/rafale. Menu déroulant biotine Distribuer 30 µL de billes magnétiques de streptavidine enduite 10 mg/mL dans un nouveau tube, séparez chacune d’elles sur un support magnétique et jeter le surnageant. Remettre en suspension les perles dans 1 x tampon B & W (5 mM Tris-Cl pH 7,4, EDTA de 0,5 mM, 1 M NaCl ; dissous dans l’eau) + 0,1 % Triton X-100 et mélanger au vortex. Placer le tube sur un support magnétique et attendez 1 – 5 min jusqu’à ce que les perles sont séparées, selon la marque et le modèle. Aspirer et éliminer le liquide surnageant tout en faisant glisser l’embout de la pipette le long du mur opposé où se trouvent les perles. Remettre en suspension les perles dans 120 µL de 2 x B & W un tampon (10 mM Tris-Cl pH 7,4, EDTA 1 mM et 2 M de NaCl). Mélanger au vortex. Transfert d’ADN cisaillé dans un nouveau tube de liaison ADN faible et mélanger avec 120 µL de la suspension de la perle dans un tampon 2 X B & W au vortex. Faire pivoter les perles avec l’échantillon d’ADN à 20 tr/min pendant 15 min. Séparer les perles sur un support magnétique et jeter le surnageant. Remettre perles de Triton X-100 dans 600 µL de 1 x B & W + 0,1 % et incuber à 55 ° C pendant 2 min, secouant à 1 000 tr/min. Après la séparation, éliminer le surnageant. Répéter une fois ce lavage. Laver les perles une fois avec 600 µL de pH 10 mM Tris-Cl 8.0 et éliminer le surnageant après la séparation. Remettre en suspension les perles dans 50 µL de pH 10 mM Tris-Cl 8.0. 5. séquençage bibliothèque préparation Remarque : Toutes les étapes de bibliothèque sont faites en utilisant des composants d’une préparation commerciale de bibliothèque ADN nécessaire (voir la Table des matières). Toutefois, les kits de rechange ou d’autres peuvent être substitués. Précipitation tend à se former dans les agents de préparation de bibliothèque au cours de la conservation au congélateur. Il est donc important de s’assurer que toutes les précipitations se dissout avant d’utiliser des réactifs. Réparation de fin Transférer la suspension de perle dans 50 µL de 10 mM Tris-Cl pH 8.0 dans un nouveau tube de PCR. Ajouter 3 µL du mélange de préparation enzymatique de fin et 7 µL de tampon de réaction prép de fin. La composition de pipetage de haut en bas. Tube de transfert à un thermocycleur et exécuter le programme suivant : 20 ° C pendant 30 min, 65 ° C pendant 30 min et maintenez à 4 ° C. Ligature de l’adaptateur Ajouter 30 µL de ligature Master Mix, 2,5 µL de 1,5 µM séquençage adaptateur (diluer à 1,5 µM de stock) et 1 µL de renforceur de ligature à la suspension de la perle. La composition de pipetage de haut en bas. Incuber à 20 ° C pendant 15 min dans un thermocycleur. Ajouter 3 µL d’enzyme de l’utilisateur. La composition de pipetage de haut en bas. Incuber à 37 ° C pendant 15 min dans un thermocycleur. Séparer les perles sur un support magnétique et éliminer le surnageant. Aux perles de lavage, de remettre en suspension les perles dans 100 µL de 1 x tampon B & W + 0,1 % X-100 Triton. Mix de vortex et le transfert dans un nouveau tube de microcentrifuge. Séparer les perles sur un support magnétique et éliminer le surnageant. Répétez ce lavage une fois à l’aide de 600 µL de tampon de la même. Remettre les billes en suspension dans 600 µL de pH 10 mM Tris-Cl 8.0, mélanger au vortex et transférer des perles dans un nouveau tube. Séparer les perles sur un support magnétique, jeter le surnageant et remettre les billes en suspension dans 50 µL de 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Amplification par PCR Préparer deux tubes PCR et dans chacun, mélanger 25 µL du mélange réactionnel de la polymérase, 1,5 µL de 10 µM avant amorce PCR (non indexés) et 1,5 µL de 10 µM inverse amorce PCR (indexé).Remarque : En avant (non indexé) amorce PCR :5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T-3´.Amorce PCR (indexée) inverse :5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T-3´. * indique les obligations phosphorothioate et Ns dans l’amorce PCR indexée. Dans chaque tube, ajouter 22 µL de suspension de perles et mélanger par pipetage de haut en bas. Exécutez la PCR en utilisant le programme suivant : 98 ° C pendant 1 min, (98 ° C pendant 15 s, 65 ° C pendant 75 s, rampe de 1,5 ° C/s) répété 9 – 12 fois, 65 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C.Remarque : Le nombre de cycles d’amplification doit être déterminée empiriquement. Cependant, nous avons trouvé que les bibliothèques nécessitant plus de 12 cycles étaient généralement de faible complexité et n’entraîne pas de haute qualité que HI-C cartes. En revanche, les bibliothèques nécessitant moins de 12 cycles ne sont pas affectées négativement en amplifiant pendant 12 cycles. Par conséquent, il est possible de par défaut à 12 cycles d’amplification. Mettre en commun les deux réactions de PCR dans un tube de microcentrifuge unique, séparer les perles sur un support magnétique et transférer le surnageant contenant la bibliothèque dans un nouveau tube. Sélection de la taille Mettre XP Ampure suspension de perle à température ambiante et mélanger bien en secouant. Porter le volume de la réaction PCR regroupée à exactement 200 µL d’eau. Au cours de la PCR et la séparation magnétique, certains du volume initial est habituellement perdue. Vérifiez le volume en définissant la pipette à 200 µL et aspirer la totalité du volume de la réaction. Si l’air est aspiré, plus l’eau doit être ajouté. Si le volume dépasse 200 µL, régler le volume des perles ajoutées aux étapes 5.4.3 et 5.4.6 proportionnellement.Remarque : Les volumes entre parenthèses sont valables si le volume total des réactions PCR commun est exactement 200 µL. Ajouter 0,55 x volumes (110 µL) de suspension de perle de Ampure XP et mélanger en pipettant également, haut en bas, au moins 10 fois. Incuber à température ambiante pendant 5 min, séparé de perles sur un support magnétique pendant 5 min. Surnageant de déménagement dans un nouveau tube. Jeter le tube contenant les billes. Les perles ont lié l’ADN > 700 bp, ce qui est trop volumineux pour être séquencé. Pour le surnageant, ajouter 0,2 x volumes (40 µL, soit un total de 0.75 x Ampure tampon non contrôlé dans l’échantillon) de suspension de perle de Ampure XP et mélanger en pipettant également monter et descendre de 10 fois. Incuber à température ambiante pendant 5 min, séparé de perles sur un support magnétique pendant 5 min. Jeter le surnageant qui contient de l’ADN < 200 bp, qui comprend des amorces gratuits, dimères d’amorce et de fragments trop petits pour être séquencé. Maintenir le tube sur le support magnétique. Perles de lavage, ajouter 700 µL d’éthanol à 80 %, en prenant soin de ne pas déranger le culot de perle et incuber pendant 30 s. Jeter le surnageant, puis prenez le tuyau sur le support magnétique et remettre les billes en suspension dans 100 µL de pH 10 mM Tris-Cl 8.0. Mélanger en pipettant également, haut en bas 10 fois et incuber à température ambiante pendant 1 min. Ajouter 0,8 x volumes (80 µL) de suspension de perle de Ampure XP. Mélanger en pipettant également monter et descendre de 10 fois et incuber à température ambiante pendant 5 min. Cette deuxième ronde de sélection de la taille limite inférieure s’assure que la bibliothèque finale est complètement libre des amorces et des dimères d’amorce. Séparer les perles sur un support magnétique pendant 5 min et jeter le surnageant. Laver le culot de perle deux fois avec 700 µL d’éthanol à 80 % pendant 30 s chacune, tout en laissant le tube sur le support magnétique, comme indiqué ci-dessus. Avec le tube encore sur le support magnétique, éliminer toute trace de l’éthanol. Il permet de pousser les gouttelettes d’éthanol hors du tube à l’aide d’une pipette de P10. Laissez l’éthanol résiduel s’évaporer pendant un maximum de 5 min. Prendre le métro sur le support magnétique et remettre les billes en suspension dans 50 µL de pH 10 mM Tris-Cl 8.0. La composition de pipetage et descendre de 10 fois. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis séparé de perles sur un support magnétique. Transférer surnageant dans un nouveau tube. Il s’agit de la bibliothèque de CIH finale, prête à être quantifié et séquencés sur machines de séquençage prochaines génération, selon les instructions du fabricant.