Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

קרום התא של התאים האיקריוטים מורכב שכבה כפולה של פוספוליפידים משובץ-חלבון אשר מגדיר את סביבת חוץ-על/תאי “אינטרה” של התא היא חיונית לשמירה על הישרדות הומאוסטזיס ותא הסלולר. קרום התא פציעות הנובעות עלבונות כימי או מכני הם דבר שבשגרה בסוגים בתרבית של תאים שונים, לרבות שלד, שריר הלב, הקיבה והריאות תאים^1,2,3,4. בנוסף פציעות הסוגר יומי תפקיד פיזיולוגי, קרום התא יכול גם להיות נפגע על ידי עלבונות סביבתיים רעלים חיידקי, פגיעה reperfusion איסכמי⁵. כישלון כדי לחתום מחדש יתבקע קרום התא מוביל תזרים ללא פיקוח של חוץ-תאית Ca^{2 +}– יחד עם רכיבים אחרים חוץ-תאית רעיל – לתוך התא, מפעילה cascades האות במורד הזרם, אשר עלולה לגרום במהירות בתא מוות^1,4,5,6.

עד כה, היו מספר דגמים המוצע לתיקון ממברנה בתאים. אולי ניתן להפעיל מנגנוני תיקון שונים תלוי בגודל אופי העלתה קרום. כך למשל, הוא הציע כי קרום התא עשויים לנצל זרימת לרוחב או חלבון סתימת לתקן שיבושים קטנים (< 1 ננומטר). המודל פיוז’ן לרוחב מציעה כי קרום יתבקע במהירות לתיקון דרך גיוס לרוחב של המכילות dysferlin ממברנה⁷, ואילו החלבון סתימת דגם מרמז כי נקבים קטנים הם לתיקון דרך הצטברויות של חלבון (בעיקר annexins) ⁸. לעומת זאת, לעורר נגעים ממברנה גדולות Ca^{2 +}-שלפוחית התלויים, בתיווך dysferlin פיוז’ן ועל היווצרות טלאי תיקון. במודל טלאי תיקון, Ca^{2 +} הזרימה המהירה לתוך התא מפעילה הגיוס של חלבונים מרובים (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ו EDH חלבונים) אשר ליצור מתחם או “תיקון”, יחד עם שילוב של שלפוחית תאיים או lysosomes באתר של הממברנה גורם נזק^4,9,10,11,12. חשוב לשים לב כי מודלים אלה אינם בהכרח סותרים, אולי לעבוד ביחד כדי להקל על תיקון קרום. כשל לחתום כראוי נזק קרום התא משויך מספר מצבי מחלה, כולל ניוון שרירים (dysferlinopathy – כולל מיושי מיופתיה, חגורת הגפיים-ניוון שרירים מסוג IIB, מיופתיה דיסטלי עם תחילת הטיביאלי הקדמי) ¹³, קרדיומיופתיה¹⁴ו- Chediak-היגאשי תסמונת (CHS)¹⁵.

נתון זה שלמות קרום התא המתאים וחתימה מחזות תפקיד כה חשוב על בריאות ומחלה, הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המולקולריים הבסיסית של תיקון קרום התא יהיה מועיל בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות. לכן,, יש להחזיק טכניקות ניסיוני המתאים כדי לפקח על קינטיקה, להעריך את היכולת של תיקון קרום התא. מספר במבחנה שיטות לסימולציה תיקון קרום עוצבו. אסטרטגיה אחת כרוכה פגיעה מכנית, אשר ניתן להקל באמצעות תא גירוד עם תער/להב פיפטה/כירורגי או על ידי גלגול חרוזי זכוכית על תאי ה-¹⁶. עם זאת, סוג זה של פציעה מכני יוצר נגעים גדולים ויוצרת רמה גבוהה של וריאציה תא לפציעה, הן בתוך והן בין תרבויות.

שיטה נוספת של יצירת פצעים ממברנה היא אבלציה לייזר על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים. בניגוד לייזר מסורתיות מיקרוסקופיה קונפוקלית מעסיקה עירור פוטון יחיד, הלייזר שני הפוטונים משתמשת בו זמנית שני פוטונים ארוך באורך הגל, אנרגיה נמוכה כדי להקל את עירור של אלקטרון בעל אנרגיה גבוהה¹⁷. תהליך ליניארי זה יוצר עירור אך ורק בתוך המטוס מוקד וגם לא לאורך כל הנתיב אור¹⁷ (איור 1). זה מופחת עירור העוצמה מסייעת למזער את נזקי כאשר הדמיה תאים חיים^18,19. חוקרים ולכן מסוגלים לייצר נגעים מדויקת קרום התא וחתימה צג ממברנה בזמן אמת באמצעות צבעי פלורסנט ו התבוננות שינויים בעוצמת פלורסצנטיות כמו קרום התא יתבקע ולאחר מכן החתימות מחדש.

בגישה זו נעשה שימוש שוב ושוב ללמוד ממברנה ופצעו בתוך חוץ גופית ו ויוו וסוגי בתא מספר^20,21. לדוגמה, ממברנה לתקן פגמים fibroblasts, myotubes נגזר dysferlinopathy חולים היו העריך באמצעות טכניקה זו,^22,23. כמו כן, סיבי שריר בודד מבודד עכברים שימשו כדי לפקח על תיקון תיקון היווצרות^13,24,25. התנועה של חלבונים מתויגות fluorescently יכול גם להיות שנצפו במהלך תיקון קרום סיבי השריר יחידה⁹. יתר על כן, התהליך של תיקון sarcolemmal בעקבות שני הפוטונים לייזר ופצעו בדג זברה העוברים נראים גם בזמן אמת אין ויוו²⁶.

במאמר זה, אנו מכינים מתודולוגיה להערכת הדינמיקה תיקון קרום התא של fibroblasts באמצעות לייזר שני הפוטונים ופצעו, למרות מתודולוגיה זו שניתן להחיל על סוגי תאים שונים לצורך לכימות קרום פלזמה חתימת יכולת במבחנה. בשיטה זו, תאים מודגרת עם FM4-64, צבע lipophilic, התא אטום אשר במהירות שזוהר כמו זה נקשר באופן שלילי טעונה פוספוליפידים בתוך הציטופלסמה עם כניסתו לתא דרך ממברנה הנגע (איור 2& 3)-כימות של זריחה צבע סמוכים הנגע ממברנה מאפשר ניטור הזמן שלוקח את קרום התא לחתום מחדש את עצמו. לצורך המחשה השירות של שיטה זו, אנו משתמשים dysferlinopathy החולה fibroblasts transfected עם פלסמידים מצומדת-GFP באורך מלא dysferlin (DYSF) כדי להעריך את החילוץ של תיקון קרום התא.