Summary

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

Published: January 02, 2018
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Summary

Zellmembran Verwundung über zwei-Photonen-Laser ist eine weit verbreitete Methode für die Bewertung der Membran Wiederverschließen Fähigkeit und kann auf mehrere Zelltypen angewendet werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für in-vitro- live-Aufnahmen von Membran Wiederverschließen in Dysferlinopathie Patientenzellen nach zwei-Photonen-Laser-Ablation.

Abstract

Zahlreichen pathophysiologische Beleidigungen können Zellmembranen schädigen und Verbindung mit angeborenen Defekten in Zellmembran Reparatur oder Integrität, können zu Krankheit führen. Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die umgebenden Zellmembran Reparatur ist daher ein wichtiges Ziel für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Erkrankungen, die mit dysfunktionalen Zellmembran Dynamik. Viele in Vitro und in Vivo Studien zum Ziel zu verstehen, Zellmembran Wiederverschließen Krankheit Kontexten nutzen zwei-Photonen-Laser-Ablation als Standard für die Bestimmung der funktionellen Ergebnisse nach experimentellen Behandlungen. In diesem Assay unterliegen Zellmembranen Verwundung mit einem zwei-Photonen-Laser, wodurch die Zellmembran zu Bruch und fluoreszierenden Farbstoff in die Zelle einzudringen. Die Intensität der Fluoreszenz in der Zelle kann dann überwacht werden, um die Fähigkeit der Zelle zu verschließen sich quantifizieren. Gibt es mehrere alternative Methoden für die Beurteilung der Zellmembran als Reaktion auf Verletzungen, als auch große Unterschiede in der zwei-Photonen-Laser Verwundung Ansatz selbst, daher würde ein einheitliches Modell der Zelle Verwundung nutzbringend zu verringern dienen der Unterschiede zwischen den beiden Methoden. In diesem Artikel beschreiben wir einen einfache zwei-Photonen-Laser Verwundung Protokoll für die Beurteilung der Zellmembran Reparatur in Vitro in beide gesund und Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten, Zellen mit oder ohne ein in voller Länge Dysferlin-Plasmid transfiziert.

Introduction

Die Zellmembran der eukaryotischen Zellen besteht aus einer Doppelschicht Protein besetzte Phospholipide, die definiert der Intra-/extrazellulären Umgebung der Zelle und ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung der zelluläre Homöostase und Zelle überleben. Zellmembran Verletzungen infolge mechanischer oder chemischer Beleidigungen sind an der Tagesordnung in verschiedenen Säugetier-Zelle Arten, einschließlich Skelett- und Herzmuskulatur, Magen und Lunge Zellen1,2,3,4. Neben Verletzungen konsequente tägliche physiologische Funktion können Zellmembranen auch durch ökologische Beleidigungen, bakterielle Toxine und ischämische Reperfusion5beschädigt werden. Brüche in der Zellmembran verschließen führt zu einem unregulierten Zustrom von extrazellulären Ca2 +– zusammen mit anderen potentiell toxischen extrazellulären Komponenten – in die Zelle auslösen nachgeschalteter Signalkaskaden, die schnell in Zelle führen kann Tod,1,4,5,6.

Bisher gab es mehrere vorgeschlagenen Modelle für Membran-Reparatur in den Zellen. Je nach Größe und Art der Membran Ruptur können verschiedene Reparaturmechanismen aktiviert werden. Es wird beispielsweise vorgeschlagen, Zellmembranen lateral Flow oder Protein um kleine Störungen beheben Verstopfung nutzen kann (< 1 nm). Die laterale Fusion-Modell schlägt vor, dass Membran Brüche durch die seitliche Einstellung des Dysferlin-haltigen schnell geflickt sind Membran7, während das Protein Verstopfung Modell schlägt vor, dass kleine Perforationen durch Protein Aggregationen geflickt werden (meist Polymerasen) 8. dagegen größere Membran Läsionen auslösen Ca2 +-abhängige, Dysferlin-vermittelten Vesicle Fusion und Bildung eines Reparatur-Patch. In der Reparatur-Patch-Modell löst ein schnelle Ca2 + Zustrom in die Zelle die Rekrutierung von mehrere Proteine (Dysferlin Polymerasen, Mitsugumin-53 und EDH Proteine) bilden ein komplexes oder “Patch”, zusammen mit einer Fusion von intrazellulären Vesikeln oder Lysosomen an der Stelle der Membran beschädigt werden4,9,10,11,12. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Modelle nicht notwendigerweise gegenseitig ausschließen sind und in Konzert funktionieren, Membran-Reparatur zu erleichtern. Nichtbeachtung der Zellmembran Schäden ordnungsgemäß zu verschließen ist verbunden mit mehreren Krankheitszuständen, einschließlich Muskeldystrophie (Dysferlinopathie – einschließlich Miyoshi Myopathie, Gliedmaßen-Gürtel Muskeldystrophie Typ IIB und distalen Myopathie mit vorderen tibiale einsetzen) 13, Kardiomyopathie14und Chediak-Higashi-Syndrom (CHS)15.

In Anbetracht, dass richtige Zellmembran Integrität und Wiederverschließen spielt eine wichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, ein tieferes Verständnis für die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Zellmembran Reparatur nützlich bei der Suche nach neue therapeutische Strategien wäre. Deshalb ist es notwendig, geeignete experimentelle Techniken zur Überwachung der Kinetics und bewerten die Fähigkeit der Zellmembran Reparatur zu besitzen. Mehrere in-vitro- Methoden zur Modellierung von Membran-Reparatur sind entworfen worden. Eine Strategie beinhaltet die mechanische Verletzungen, die durch die Zelle zu kratzen, mit einer Pipette/chirurgische Messer/Rasiermesser oder durch die Zellen16Glasperlen überrollen erleichtert werden kann. Jedoch diese Art von mechanischen Verletzungen erzeugt größere Läsionen, und schafft ein hohes Maß an Variation Zelle Verletzung, sowohl innerhalb als auch zwischen den Kulturen.

Eine weitere Methode zur Generierung von Membran Wunden ist Laser-Ablation durch zwei-Photonen-Mikroskopie. Im Gegensatz zu traditionellen konfokale Lasermikroskopie, das einzelne Photon Erregung beschäftigt, nutzt die zwei-Photonen-Laser gleichzeitig zwei langwellige, Niedrigenergie-Photonen, um die Anregung einer hochenergetischen Elektronen17zu erleichtern. Diese nichtlinearen Prozess führt zu Erregung ausschließlich in der Brennebene und nicht entlang der gesamten Lichtweg17 (Abbildung 1). Dies reduziert Erregung Volumen hilft lichtbedingten minimieren beim lebenden Zellen18,19abbilden. Forscher sind daher in der Lage, präzise Läsionen in der Zellmembran und Monitor Membran Wiederverschließen in Echtzeit durch die Verwendung von fluoreszierender Farbstoffen und Beobachtung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität als die Zellmembran Brüche und dann Sicherheitsventilen zu generieren.

Dieser Ansatz wurde wiederholt verwendet, um die Membran Verwundung in Vitro und in Vivo zu untersuchen und mehrere Zelle eingibt20,21. Z. B. Membran reparieren defekte in Fibroblasten und Myotubes, abgeleitet von Dysferlinopathie, die Patienten wurden anhand dieser Technik22,23. Darüber hinaus wurden einzelne Muskelfasern von Mäusen isoliert verwendet, um Reparatur Patch Bildung13,24,25zu überwachen. Die Bewegung der Gewebekulturen tagged Proteine kann auch während der Reparatur der Membran in einzelnen Muskelfasern9beobachtet werden. Darüber hinaus kann der Prozess der sarcolemmal Reparatur nach zwei-Photonen-Laser Verwundung in den Zebrafish Embryos in Echtzeit in Vivo26beobachtet werden.

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methodik für die Bewertung der Zellmembran Reparatur Dynamik in Fibroblasten mit zwei-Photonen-Laser verletzt wurden, obwohl diese Methodik zu verschiedenen Zelltypen zur Quantifizierung der Plasmamembran Wiederverschließen Fähigkeit angewendet werden können in Vitro. Bei dieser Methode werden mit FM4-64 Zellen inkubiert, ein lipophiler, Zelle-undurchlässigen Farbstoff, der schnell fluoresziert wie es an negativ bindet aufgeladen Phospholipide im Zytoplasma beim Eintritt in der Zelle durch die Membran-Läsion (Abbildung 2& 3). Quantifizierung der Farbstoff Fluoreszenz angrenzend an die Membran Läsion ermöglicht eine Überwachung der Zeit, die für die Zellmembran zu selbst zu verschließen. Um das Dienstprogramm dieser Methode zu veranschaulichen, verwenden wir Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten transfiziert mit GFP konjugiert in voller Länge Dysferlin (DYSF) Plasmide um die Rettung der Zellmembran Reparatur zu beurteilen.

Protocol

In dieser Studie verwendete menschlichen Fibroblastenzellen wurden mit Zustimmung der menschlichen Ethik-Kommission der Fakultät für Medizin und Zahnmedizin an der Universität von Alberta eingesetzt. 1. die Transfektion von Zellen mit durchgehender DYSF plasmid Kultur-Fibroblastenzellen in einem T225 Kolben mit 40 mL Wachstumsmedien – 36 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM), 4 mL des fetalen bovine Serum (FBS) und 20 µL von Penicillin/Streptomycin (P/S) – in einem CO2…

Representative Results

Gesunde menschliche Fibroblasten, unbehandelten Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten und Patienten Fibroblasten transfiziert mit einem Plasmid mit die Full-length Dysferlin-Sequenz ausgesetzt waren zwei-Photonen-Laser Verwundung Membran Wiederverschließen Fähigkeit zu bewerten in Echtzeit. Gesunde menschliche Fibroblastenzellen angezeigt niedrigen Niveau von FM 4-64 Fluoreszenz Aktivierung nach Laser Verwundung und unbehandelten Patienten Fibroblasten zeigte ein hohes Maß an relativ…

Discussion

Zwei-Photonen-Laser Verwundung der Zellmembran ist eine genaue und vielseitige Technik für die Beurteilung der Dynamik der Membran Wiederverschließen in Vitro. In diesem Artikel beschriebenen wir ein Protokoll für die Bestimmung der Zellmembran Wiederverschließen Fähigkeit in Dysferlinopathie Patientenzellen mit dem zwei-Photonen-Laser Verwundung Assay. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Dysferlinopathie Patienten Zellen Defekt in Zellmembran Wiederverschließen, das steht im Einklang mit Ergebnissen von andere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Universität von Alberta Fakultät für Medizin und Zahnmedizin, die Freunde von Garrett Cumming Stuhl Forschungsfonds, HM Toupin neurologische Forschung Stuhl Wissenschaftsfonds, muskulöse Dystrophie Kanada, Canada Foundation für Innovation (CFI) unterstützt, Alberta erweiterte Bildung und Technologie (AET), kanadische Institute der Gesundheitsforschung (CIHR), Jesse Reise – die Grundlage für gen und Zelltherapie, die Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) und Alberta Health Solutions (AIHS erneuert ).

Wir möchten Dr. Steven Laval danken für die Bereitstellung von uns mit dem Full-length Dysferlin-Plasmid. Wir möchten auch Dr. Katsuya Miyake für technische Beratung bedanken.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11320033
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher 25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
35mm collagen-coated glass-bottom dishes MatTek P53GCOL-1.5-14-C
Serum-deprived media Thermo Fisher 31985070
Transfection reagent Thermo Fisher 15338100
FM 4-64 Dye Invitrogen T13320
Tyrode’s Salts Solution Sigma-Aldrich T2397
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss NA
Chameleon Two-photon laser Coherent NA

References

  1. Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
  2. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).
  3. McNeil, P. L., Ito, S. Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo. Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).
  4. McNeil, P. L., Kirchhausen, T. An emergency response team for membrane repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).
  5. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  6. Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells. Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).
  7. McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair. FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).
  8. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).
  9. Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).
  10. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).
  11. Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).
  12. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  13. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).
  14. Han, R., et al. Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury. J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).
  15. Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  16. Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses. Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).
  17. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  18. Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo. Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).
  19. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
  20. McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).
  21. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J Vis Exp. (52), (2011).
  22. Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair. PLoS Curr. 7, (2015).
  23. Philippi, S., et al. Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy. PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).
  24. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).
  25. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).
  26. Roostalu, U., Strahle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).
  27. Azakir, B. A., et al. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).
  28. Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. Ch 6. Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).
  29. Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).

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Cite This Article
Lee, J. J. A., Maruyama, R., Sakurai, H., Yokota, T. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. J. Vis. Exp. (131), e56999, doi:10.3791/56999 (2018).

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