인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

보통, 취소 확인 된 인간 성인 장 조직 생활, 미시간의 선물을 통해 죽은 장기 기증자에서 얻은 했다. 인간의 ES 세포 선 H9 (NIH 레지스트리 #0062) WiCell 연구소에서 얻은 했다. 이 작품에 사용 하는 모든 인간의 조직 아닌 살아있는 기증자 로부터 얻은 하 고 취소 확인 되었다 미시간 대학 IRB (프로토콜 # HUM00093465 및 HUM00105750)에서 승인 된 실시 했다. 1. microinjector 설치 자료 테이블에 나열 된 자료를 얻을. Micromanipulator, 해 범위 및 광원은 biosafety는 캐비닛 놓습니다. 70% 에탄올 또는 실험 사용 전에 다른 살 균 제 microinjection 설치를 청소. Microinjection 장비를 부식 수 있습니다 표 백제를 포함 하는 소독 제에 장시간된 노출을 하지 마십시오.참고: 완전 한 microinjector 어셈블리의 예는 그림 1에 표시 됩니다. 눈 조각 biosafety 캐비닛에 대 한 방패에 액세스 포트를 통해 사용할 수 있도록 해 범위를 배치 합니다. 또는 깨끗 한 벤치를 사용 하 여 현미경 액세스 포인트와 캐비닛 biosafety 대신 긍정적인 공기 흐름 시스템. 제조업체의 지침에 따라 현미경의 오른쪽에는 micromanipulator를 조립 하 고 컨트롤을 쉽게 도달 하 고 조정할 수 있도록 조정 합니다. micromanipulator 철판에 장착 하거나 그렇지 않으면 안정 해야 합니다.참고: 왼손잡이 사용자는 micromanipulator 해 범위의 왼쪽에 배치 할 수 있습니다. 탑재 micromanipulator 팔 micropipette 홀더 micropipette 홀더에 삽입 하 여 아날로그 튜브를 연결 합니다. 살 균 미네랄 오일의 약 5-7 mL와 10 mL 유리 주사기를 채우십시오. 연결 10 mL 유리 주사기 Luer 잠금 메커니즘을 사용 하 여 아날로그 튜브의 오픈 엔드에 미네랄 오일으로 가득 합니다. micromanipulator에서 반대 해 범위의 왼쪽 유리 주사기를 놓습니다. 부드럽게 튜브를 통해 미네랄 오일 밀어 주사기, 우울. 미네랄 오일의 약 10 방울 micropipette 소유자의 끝에서 플러시 페 트리 접시 또는 이와 유사한 용기에 수집 하 고 삭제.참고:이 단계는 배관에서 모든 공기를 제거 하 고 각 microinjection 세션 전에 수행 되어야 합니다. 2입니다. microinjection에 대 한 준비 24 시간 이전에 microinjection: 다시 살 균 PBS 또는 염 분 2 mg/mL의 농도에서 FITC dextran을 일시 중단 하 여 FITC dextran 솔루션을 준비 합니다. 준비의 총 볼륨 > 250 µ L.참고: FITC dextran의 더 높은 또는 낮은 농도 사용할 수 있습니다에서 배열 약 0.1-10 mg/mL. FITC-dextran 하류 이미징 응용 프로그램에 맞게 농도 조정 합니다. 4 또는 8 잘 유리 챔버 슬라이드 또는 적합 다른 문화 선박에 설치 organoid 문화 살 현미경 검사 법, 최대 4-6 HIOs 잘, 50 µ L 셀 매트릭스 솔루션에 포함 하 고 EGF, 머리 및 R-Spondin (ENR) 성장 인자 미디어 19 양식 당 24. 우주는 organoids 균등 하 게 (약 5 m m 떨어져) 실시간 이미징 분석 중 현미경의 단일 필드에 여러 HIOs 캡처 피하기 위해 주의. 하이 오 문화 및 유지 보수 완전 한 가이드 참조 McCraken 외. 24.참고:이 프로토콜 사용 하 여 줄기 세포 파생 HIOs 개발 되었다 고 대표 결과 (아래 참조)이 조직 문화 모델의 사용을 보여 줍니다. 그러나, 같은 프로토콜은 쉽게 조직 파생 장 상피 organoids15,29에 적응 된다. 조직 파생 HIOs는 PSC 파생 HIOs 부족 지원 엽 basolateral 셀 구조15,,2930보다 일반적으로 더 작다. Microinjection 조직 파생 HIOs의 기술 능력의 더 큰 학위를 필요로 하 고 경험 수 있습니다. 정도는 상피 장벽 침투성 데이터 HIOs 조직 파생을 사용 하 여 얻은 hPSC 파생 HIOs 연관 수 있습니다 알려져 있습니다. Microinjection 이전에 42 ° C, 5% CO2 표준 세포 문화 인큐베이터에서 HIOs를 품 어. 30 분 microinjection, 전에 biosafety 캐비닛 켜고 최적의 작업 높이 유리 방패를 올립니다. Biosafety 내각에서 모든 불필요 한 항목을 제거 합니다. 잡동사니 공간 감 금에서 일 때 유출 또는 다른 사고 위험을 증가. 스프레이 하 고 철저 하 게 70% 에탄올 또는 다른 살 균 제와 작업 표면 청소. 깨끗 한 종이 타월을 사용 하 여 닦으십시오. microinjector에 부착 된 유리 주사기에 미네랄 오일의 수준을 확인 합니다. 나머지는 미네랄 오일의 3 mL 미만 경우 주사기를 나사 고 biosafety 내각, 거품 소개 되지 않도록 주의 하면서 내부 리필. 7 mL 이상 채우지 마십시오. 설정 해 범위를 조명 하는 램프. 개인적인 편안 함을 위해 접 안 렌즈를 조정 합니다. 위치 해 범위의 오른쪽 micromanipulator입니다. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 철판에 micromanipulator 보안. 마그네틱 스탠드는 micromanipulator의 위치를 조정 하 고 스탠드 철 격판덮개를 ON 위치로 마그네틱 스탠드를 설정 하 여 보안을 OFF 위치로 전환 합니다. Microcapillary 설치 제조업체에서 제공 하는 스토리지 컨테이너에서 단일 1 m m 유리 필 라 멘 트를 검색 합니다. Micropipette 끌어당기는의 구리 난방 코일의 센터를 통해 유리 필 라 멘 트를 삽입 합니다.참고: micropipette 끌어당기는 준비 가이드에 대 한 그림 2 를 참조 하십시오. 구리 난방 코일 필 라 멘 트 유리 중간 약은 되도록는 필 라 멘 트를 놓습니다. 이렇게 하면 끌어당기는 각 유리 필 라 멘 트 로부터 두 개의 사용 가능한 microinjection 바늘을 생성. 유리 필 라 멘 트를 사용 하 여 상단을 강화 하 여 클램프 클램프 먼저, 필 라 멘 트 유리 파손을 방지 하기 위해 노치 그로브 내 보안 확인 하 고 보호 합니다. 하단 클램프를 강화 하기 전에 최대 수직 위치로 끌어당기는 팔을 연장.참고:이 단계는 필수적입니다. 완전히 끌어당기는 팔 연장 실패 유리 필 라 멘 트의 두 섹션의 불규칙 한 분리 됩니다. 열 및 메커니즘을 당기에 설정을 확인 합니다.토글 (990)와 열 # 1을 선택 하 고 설정 059 (그림 2)에서 당겨. On/Off 토글을 사용 하 여 악기를 켭니다. 보호 플 쉴드 닫고 끌어당기는의 하단 오른쪽 얼굴에 당겨 단추를 누릅니다. 구리 코일 열에 시작 되 고 밝은 오렌지 빛을 낼 것 이다. 온도 상승, 스트레칭 하 고 결국 별도 유리 필 라 멘 트 시작 합니다. 유리 필 라 멘 트의 두 끝을 분리 시 악기의 파워 다운.참고: 구리 코일 유지 됩니다 매우 뜨거운 몇 분 동안. 가져온된 유리 필 라 멘 트 프로토콜에이 시점에서 ‘microcapillary’로 지칭 합니다. 구리 코일을 만지지 마십시오, 유리 microcapillaries 중 하나를 제거 하 게 주의 되 고. microcapillary 아주 좋은 포인트가 있어야 합니다. 라텍스 또는 니트 릴 장갑과 신중 하 게 microcapillary를 처리 하 고 즉시 microinjector 설치를 포함 하는 biosafety 내각을 진행 합니다.참고: 유리 microcapillary는 매우 샤 프 하 고 매우 깨지기 쉬운. 관심을가지고 처리 합니다. Micromanipulator 팔의 마 개를 풉니다. 가져온된 microcapillary의 무뚝뚝한 끝 micropipette 소유자의 열린 끝에 삽입 하 고 밀어 안쪽까지 중지. 엔드 캡을 다시 조여 micromanipulator 팔 microcapillary의 무뚝뚝한 끝을 보안 합니다.참고: microinjection 시스템에는 microcapillary를 설치할 때 주의 날카롭게 끝을 만지지 마십시오. 이 오염 가능성을 줄일 것입니다. 그리고 microinjection에 대 한 훌륭한 포인트를 유지. 올바르게 확보는 microcapillary를 microinjection 동안 불안정 또는 유리 필 라 멘 트의 파손에 발생할 수 있습니다. 유리 microcapillary의 팁을 엽니다. 가져온된 유리 microcapillary의 준비, 동안 포인트의 팁은 microcapillary의 뾰족한 끝을 밀봉 하기 위하여에 녹아 가능성이 것입니다. 이 막힘을 제거: 위치는 micromanipulator 하는 microcapillary이 표면을 없이 해 범위의 유리 단계에서 아래로 지적 이다. 살 균 플라스틱 표면 찾기 (문화 접시 뚜껑의 아래쪽은 완벽 하 게 작동) 해 범위의 단계에 microcapillary 바늘 아래 직접 현미경 스테이지에 놓습니다. 보기 영역에서 microcapillary의 팁 가운데 고 아래 1.5 배 확대 현미경의 접 안 렌즈를 통해 볼 때 표시 되는 확인 합니다. Micromanipulator 팔 사전 천천히 micromanipulator 컨트롤을 사용 하 여 및 팁 겨우 연락처는 microcapillary의 팁 및 플라스틱 표면 때까지 무 균 플라스틱 문화 뚜껑 쪽으로 microcapillary 무료 휴식.참고: microinjection 중 고 하이 오에 피해를 최소화 하기 위해서는 유리 필 라 멘 트에서 유체 흐름에 대 한 허용 가장 작은 가능한 휴식에 대 한 목표. 다시 진행 하기 전에 실수로 파손의 기회를 최소화 하기 위해 살 균 표면에서 microcapillary. 유리 주사기, 튜브를 통해 미네랄 오일 추진 우울 하 여 흐름에 대 한 microcapillary를 확인 하십시오. microcapillary의 끝이 열려 있으면 몇 초 후에 microcapillary의 끝에서 등장 미네랄 오일의 작은 작은 물방울을 표시 됩니다. 이 발생 하지 않으면 이전 단계 고 다시 테스트를 반복 합니다. 3. 살 균 Microinjection 참고: microcapillary는 준비, 설치, 및 테스트 된, 일단 microinjecting HIOs 시작. 그림 3 에 조직 파생 HIO를 성공적으로 주입 FITC dextran을 보여 줍니다. 사출 재료에는 microcapillary를 채우십시오. 에 FITC dextran 주입, 측면 또는 튜브의 하단에 대 한 microcapillary의 팁을 위반 되지 않도록 주의 하면서 유리 microcapillary의 끝 잠수함 microcapillary의 팁 솔루션에 빠져들은, 일단은 microcapillary에 FITC dextran 현 탁 액의 약 10 µ L를 그릴 미네랄 오일 주사기에 다시 당겨.참고: 그것 때문에이 설치 된 microcapillary에 가장 쉽게 액세스할 수 있을 것입니다 주입 솔루션/문화에 대 한 1.5 mL 또는 0.5 mL 튜브를 사용 하 고 좋습니다. 또는, 주입 멸 균 페 트리 접시 또는 살 균 parafilm이에 튜브를 필요를 제한 하 여 sharps 부상의 위험을 줄일 수 있습니다 솔루션을 그릴 수는 microcapillary에 근접을 닫습니다. 현 탁 액은 높은 점성 또는 microcapillary의 개통은 매우 작은 경우, 두 번째는 microcapillary을 채우기 위해 몇 가지 걸릴 수 있습니다. 이 전체 microinjection 시스템을 오염 시킬 수 있습니다으로 플라스틱 microinjection 튜브에 microinjection 정지를 그릴 하지 않습니다. Microinjection 정지 채우면 유리 microcapillary의 길이의 90%는 microcapillary를 작성 중지 합니다. microcapillary는 microcapillary의 끝의 공기 주머니를 포함 하지 않는 수 있도록 microinjection 솔루션에서 철수 하기 전에 주사기를 약간 우울.참고: 경우에 microcapillary의 시험 공기의 포켓을 보여준다, 빈 및 다시 작성. microinjector와 셀 문화 인큐베이터 및 전송에서 캐비닛 biosafety HIO 문화 plate(s)을 제거 합니다. 하이 오 문화 접시 biosafety 내각 내에서 뚜껑을 제거을 그것은 명확 하 게 가장 낮은 배율 설정 범위의 접 안 렌즈를 통해 볼 수 있도록 현미경 스테이지에 첫 번째 잘 중앙. 그런 각도에서 잘 HIO 문화에 아래로 microcapillary 지적 micromanipulator 팔을 돌려 > 현미경 단계를 기준으로 45 °. 이것은 가장 쉽게 수동으로 수평 micromanipulator 팔 지원 만나는 지점 수직 스탠드 잘 컨트롤 (블랙 다이얼)의 한정 된 범위 때문에 수평 축에 micromanipulator 팔 어셈블리를 설정 하 여 수행 동작입니다. 미디어 (그림 3A)의 표면 위에 대략 1 cm에서 첫 번째 문화 위에 microcapillary의 끝을 놓습니다. 조직에서 파생 된 장 상피 organoids의 microinjection를 보여주는 대표적인 이미지는 그림 3B에 표시 됩니다. 유리 필 라 멘 트 끝에 HIO(s) 모두 접 안 렌즈를 통해 볼 수 있습니다 확인 하십시오. 필요한 경우 다시 위치입니다. Z 축 컨트롤 노브를 시계 방향으로 선회 하 여 천천히는 microcapillary를 사전.참고: microcapillary 팁의 위치 판단, 특히 깊이, 연습을 해야 합니다. 팁 위반 미디어의 표면, microcapillary 끝의 약간의 시각적 왜곡 알.주의 HIOs 손상 하거나 문화 접시의 바닥에 대 한 microcapillary을 피하기 위해이 시점에서 진행 한다. 피어스 microcapillary 팁 하이 오. 하는 오의 외부 표면은 microcapillary 압력을 적용 하기 시작 하 고 팁 루멘을 침투 하는 모양으로 다시 나타납니다 약간 우울 합니다. 하이 오 루멘 내의 microcapillary의 끝을 식별 하는 어려울 수 있습니다. 경우에 microcapillary를 보고 하는 어려움 조명 또는 배율 설정 해 범위를 조정 합니다. microcapillary는 하이 오의 중앙 microcapillary의 팁 위치 올바르게 때 손을 micromanipulator 컨트롤에서 제거 합니다. 미네랄 오일 주사기는 microcapillary 그리고 HIO 루멘으로 microinjection 솔루션을 약간 우울 하이 오 주사의 볼륨을 수용 하기 위해 약간 확장 될 수 있습니다.참고:이 파열 organoid 발생할 것 이다-는 하이 오를 작성 하지 않도록 주의 하십시오. 엄지손가락의 규칙으로 서 하이 오 볼륨의 모든 표시 확장 중지 시간이 의미 합니다. 성숙한 HIO 루멘의 평균 볼륨 약 1 µ L 이지만 크게 다를 수 있습니다. 자동 주사기 펌프는 주입 된 볼륨의 제어할 수 있도록 수동 주사기 대신 사용할 수 있습니다. Z 축 제어 및 미디어의 표면 위에 위치를 사용 하 여 하이 오에서 있는 microcapillary을 철회. 미디어 공작 동안에 HIOs 우발적인 손상을 방지 하 고 비슷한 방식으로 주사를 위에 위치 하는 microcapillary와 다음 HIO 대상 이동 (참조 단계 3.6-3.11). 위에서 설명한 방법을 사용 하 여 microcapillary 리필.참고: 주사를 계속을 경우 팁은 microinjection 중 어느 시점에서 휴식, 시도 하지 마십시오. 아래의 지침에 따라 팁을 변경 합니다. Microcapillary 파손 또는 치료 사이 변경 합니다. Micromanipulator 팔의 끝에 클램프를 풀고 고 micropipette 홀더에서 microcapillary를 제거 합니다.주의: 팬 들은 날카로운 끝의 가까이 microcapillary의 정보를 처리 하지 않습니다. 좋은 포인트는 microcapillary의 매우 날카로운 이며 쉽게 장갑과 피부를 찔린 것 이다. 주의 사용 하 고 조작만 하 고 결코 배치는 microcapillary의 포인트와 하이 오 문화 사이의 손을 사용 하 여 microcapillary를 처리 하는 모든 움직임에 유의. 전염 성 요원 또는 독 소를 포함 하는 microcapillary에서 바늘 막대기 경우 즉시 치료를 추구 합니다.참고: 경우에 따라 그것은 어려울 수 있습니다 시각적으로 성공적인 HIO microinjection 확인 하. 분명 microinjection 정지의 가시성 또한 FITC dextran의 높은 농도의 사용 향상 될 수 있습니다. 4. HIOs의 약물 치료 꼭대기 상피 하 전달 화합물 테스트, 2 mg/mL FITC dextran을 포함 하는 메 마른 PBS에 resuspend 하 고 HIO 루멘 (제 3) 위에 표시 된 대로로 microinject. 대표적인 실험 FITC dextran을 포함 하는 PBS에 Clostridium 남과 어울리지 않는 독 소 TcdA 12.8 ng / µ L을 resuspend. Basolateral 구획에 전달 하는 화합물을 테스트 하려면 바꿉니다 외부 문화 미디어 뉴 미디어 2mm 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, 포함 N, N’, N’-tetraacetic 산 (EGTA)(positive control), PBS 차량 혼자 (부정적인 제어 ), 또는 microinjection FITC dextran의 후 다른 실험적인 화합물.참고: 투약 하 고 약리학 적인 화합물, 독 소, 또는 다른 에이전트의 응용 프로그램의 타이밍 실험 질문에 따라 달라질 수 있습니다. 5. 라이브 Microinjected Organoids의 Imaging 라이브 이미징 즉시 다음 microinjection를 시작 합니다. 형광 현미경 자동된 라이브 셀 이미징 시스템 21% O2 및 5% CO2 , 37 ° C에서 유지 하는 습도 챔버를 갖춘 문화 접시를 전송 합니다. 환경 챔버를 닫고 이미징 프로세스를 시작 합니다. 바탕 화면에서 이미지 분석 소프트웨어 (예: softWoRx)를 시작 합니다. “파일”을 클릭 하 고 “(해결 3D) 취득” 영상 및 현미경 제어 소프트웨어를 선택 합니다. FITC 여기/방출 설정 (475 nm 여기/523 nm 방출), 5%, 및 4 X 렌즈 전송 전력 설정. 0.025 ms (그림 4A)에 노출 시간을 설정 합니다.참고: 노출 시간 형광 신호에 맞게 변화 해야 한다. 일반적으로, FITC 형광 신호가 줄어듭니다만. 따라서, 최대 감도 보장 하기 위해, 초기 노출 시간 조정 되어야 한다는 기록 된 형광 신호 카메라와 이미징 소프트웨어의 포화 지점 바로 아래. HIOs 4 배 확대 현미경에 부착 된 디지털 컨트롤러를 사용 하 여 찾을. 센터 보기 필드 (그림 4A) 내 하이 오. 도구 모음에서 “보기”를 클릭 하 고 “포인트 목록” 선택 새 창 공개. “지점을 표시” 클릭 지점 목록 (그림 4A)에서 무대의 현재 위치를 저장 하는 데. 5.4와 5.5 단계를 반복 하 여 모든 HIOs의 위치 기록 되었습니다. Using 메모장 이나 디지털 기록, 적어 각 프로그램된 현미경 위치와 해당 위치에 촬영 된 이미지에 할당 된 고유 ID 번호. 이미지 파일이 ID 번호 태그로 그리고 데이터 수집 완료 된 후 특정 HIOs와 치료 이미지 ID 번호를 연결 하는 것이 중요할 것 이다. 자동된 이미지 컬렉션을 설치 하려면 도구 모음에서 “파일” 그리고 “실험”을 클릭 합니다. 이름 날짜 또는 다른 고유 이름을 가진 실험. 그림 4B에서 같이 각 옵션 탭을 통해 이동 하 여 이미지 컬렉션에 대 한 매개 변수를 설정 합니다. 유엔-확인 “Z 단면” 탭의 “단면”. “채널” 탭에서 맨 왼쪽 “해결 3D” 창에서 매개 변수를 입력 합니다. 시간을 절약 하려면 첫 번째 행 자동으로 채웁니다 때에 왼쪽에 있는 상자에 확인. 탭에서 ‘ 시간 경과 “,”시간 경과”라는 상자를 확인 하 고”계시”와” 총 시간 “을 표시 하는 행에 실험의 전체 기간을 표시 하는 행에 이미지 사이의 시간 간격을 입력. 소프트웨어 시간 점의 수를 자동으로 계산 됩니다. “포인트” 탭에서 “방문 포인트 목록” 확인란을 선택 합니다.또한 수동으로 텍스트 상자에 입력 하 여 실험에 포함 될 특정 소수점을 입력할 수 있습니다. “패널” 또는 “작업” 탭에서 기본 옵션을 변경 하지 마십시오. “실행” 탭 입력 상자에 실험의 날짜를 클릭 “이미지 파일 이름”을 표시 하 고 저장 위치 “설정”에서 데이터를 설정 합니다. 실험 매크로 실행 하려면 녹색 화살표를 클릭 하십시오. 시간 경과 카운터 실험 진행 상황을 추적 합니다. 계획된 시간 과정의 끝에, 수출 하 고 24 비트 RGB TIFF 이미지 (그림 4C)으로 모든 이미지 파일을 저장 합니다. 도구 모음에서 작업 작성기 다음 프로세스를 선택 합니다. 작업 작성기 메뉴에서 5.9에 지정 된 데이터 폴더를 이동 하 여 파일을 추가 합니다. 프롬프트에서 “*.dv”를 입력 하 여 “.dv”로 끝나는 모든 파일을 강조 표시 합니다. 모든 (Ctl + A)을 선택 하 고 “추가”를 클릭 합니다. + “작업.” 라고 표시 된 섹션에서 클릭 하십시오 “내보내기…”를 선택 하 고 “옵션” 탭을 클릭 하십시오. “내보내기 형식” “TIFF 이미지”를 설정 하 고 “사용자 지정 출력 폴더”를 추가 하려면 아래 확인란. TIFF 이미지를 내보낼 위치입니다. “TIFF 출력 형식”에서 24 비트 RGB를 선택 하 고 “완료”를 클릭 합니다. 내보내는 매크로 실행 하려면 “큐를 제출”을 클릭 합니다. 다른 컴퓨터에 포스트 이미징 분석 (제 6 항)을 수행 하려는 경우 외부 드라이버 또는 서버 5.11에 내보낸 TIFF 이미지를 복사 합니다.참고: HIO 조직과 미디어 저장 될 수 있습니다 조직학34, PCR35), 서쪽 오 점36또는 다른 다운스트림 분석. 6. 후 영상 분석 ImageJ37 설치 되어 있는지 확인 하 고 분석에 사용 될 컴퓨터에서 제대로 작동.참고: 피지37 은 ImageJ 코어 프로그램 작동의 다른 배급이이 분석을 위해 동등 하 게 잘. ImageJ 메뉴에서 “프로세스” “일괄 처리”와 “매크로”를 선택 하 여 일괄 처리 분석을 시작 합니다. 실험 시간 동안 수집 된 TIFF 이미지가 포함 된 디렉터리에 대 한 입력을 설정 합니다. “Thesholdmeasure.ijm” ImageJ 매크로 파일 또는 직접 복사/붙여넣기 매크로 코드 창에. “프로세스” 파일을 처리 하려면 클릭 합니다.참고: 최소 임계값 값 x (setThreshold(x,255);) 0-모든 숫자를 설정할 수 있습니다 255 배경 형광을 제거 하기 위하여 조정 한다. 값 < 100는 것이 좋습니다. 경험적으로 적절 한 임계값을 확인 하려면 단일 이미지를 대표 하는 형광 신호를 organoid 이미징 매크로 실행 합니다. 이 이미지의 평균 강도 임계값을 적절 하 게 설정 하기 위한 가이드로 사용할 수 있습니다. 아래 제시 하는 대표적인 분석에 대 한 임계값 “42”로 설정 되었습니다. ImageJ 임계값 강도 범위 내의 모든 픽셀의 영역을 포함 하는 큰 테이블을 생산할 예정 이다 그리고 임계값 강도 한계 내에서 영역에 대 한 평균, 중간값, 최소값, 및 최대 (제한) 강도 값. 이 CSV 또는 XLS로 저장 합니다. 시간이 지남에 강도 변화는 아래 계산을 수행 하는 데이터 테이블을 조작 하 여 스프레드시트39 에서 계산 될 수 있다 또는 언어 프로그래밍 자동화를 사용 하 여 적당 한 될 수 있습니다. R 40 에 작성 한 예제 분석 스크립트는이 원고와 함께 제공 됩니다.참고: 각 하이 오에 대 한 상대적인 형광 강도 수 있습니다 측정할 수로 . 제거 시간 41 (t1/2)의 FITC dextran HIO 루멘에는 다음과 같이 계산 되었다. 첫째, 계산 하는 “곡선 아래의 영역” (AUC)로 시간 (t) 동안 상대 형광 강도 설명 하는 곡선에서: 그런 다음 “정리”를 계산 () t 에서 정규화 된 형광에 대 한 1로 정의 된 배포 (Vd)의 볼륨 속도 = 0: 다음, “제거 속도 상수” 정의 ()로: 마지막으로, “” 제거 시간을 계산 하 고 (t1/2)로: 감소 된 방정식은 이렇게: