JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Published: January 10, 2018
doi:
10.3791/56953
, ,
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Bu yöntem klonlama, ifade ve yapısal tayini için rekombinant Nsa1 arınma x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS) tarafından açıklar ve diğer proteinlerin hibrid yapısal analiz için geçerlidir her ikisi de içeren düzenli ve düzensiz etki alanları.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) elde ribozom derleme faktörü Nsa1 tam uzunlukta yapısını belirlenmesi zor nedeniyle düzensiz ve proteaz değişken C-terminus protein. Bu el yazması x-ışını kristalografisi ve SAXS göre yapısal analiz için S. cerevisiae üzerinden rekombinant Nsa1 arındırmak için yöntemleri açıklar. X-ışını kristalografisi Nsa1 iyi N-terminal WD40 etki alanı yapısını çözmek için kullanılmıştır ve sonra SAXS Nsa1, C-terminus yapısında çözüm çözmek için kullanıldı. Çözüm saçılma veriler çözüm tam uzunlukta Nsa1 üzerinden toplanmıştır. Teorik saçılma genlikleri WD40 etki alanı yüksek çözünürlüklü kristal yapısı hesaplanan ve C-terminus Nsa1, katı vücut ve ab initio modelleme bir arada ortaya koydu. Bu melez yaklaşımla tüm protein dördüncül yapısının yeniden. Burada sunulan yöntemleri genel olarak yapılandırılmış ve yapılandırılmamış etki alanları karışımından oluşan diğer proteinlerin hibrid yapısal kararlılık için uygulanabilir olmalıdır.

Introduction

Ribozom mRNA tüm canlı hücrelerdeki protein dönüştürerek httpd’ye temel rolü gerçekleştirmek büyük Ribonükleoprotein makinelerdir. Ribozom ribozom biyongenezi1,2,3,4olarak adlandırdığı karmaşık bir süreç içinde üretilen iki altbirimden oluşur. Ökaryotik ribozom derleme gerekli ribozomal derleme faktörler2,3,5yüzlerce yardımıyla dayanır. Nsa1 (Nop7 ilişkili 1) özellikle büyük ribozomal altbirimde6üretimi için gerekli olan bir ökaryotik ribozom derleme bir faktördür ve WD yineleme olarak bilinen 74 (WDR74) daha yüksek organizmaların7içeren. WDR74 fareler8blastosist oluşumu için gerekli olduğu gösterilmiştir ve WDR74 düzenleyici sık kanser hücreleri9‘ mutasyona uğramış. Ancak, işlev ve Nsa1/WDR74 kesin mekanizmaları ribozom derlemesinde hala büyük ölçüde bilinmeyen vardır. Nsa1/WDR74 rolü ökaryotik ribozom olgunlaşma sırasında ortaya çıkarmak başlamak için birden çok yapısal analiz, x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS)10gibi yapıldı.

X-ışını kristalografisi, Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, elektron mikroskobu ve SAXS makromoleküllerin yapısı eğitim için tüm önemli teknikler vardır. Boyut, şekil, kullanılabilirliğini ve kararlılığını belirli bir makromolekül en iyi olacak Yapısal Biyoloji yöntemi uygun oluştururlar etkiler, ancak bir çok teknik bir sözde “melez” yaklaşımla birleştirerek haline geliyor bir giderek daha faydalı aracı11. Özellikle x-ışını kristalografisi ve SAXS yapısal oluştururlar12tespiti için güçlü ve tamamlayıcı yöntemler vardır.

Kristalografi ribozom gibi büyük hücresel makine küçük moleküller arasında değişen yüksek çözünürlüklü atomik yapıları sağlar ve proteinleri ve diğer biyolojik fonksiyonların anlamada çok sayıda devrimler yol açmıştır oluştururlar13. Ayrıca, uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım hesaplama yöntemleri, ilaç bulma ve geliştirme14için kritik bir boyut ekleme tarafından Moleküler yerleştirme için kristal yapıları gücünü. Onun geniş uygulanabilirliği rağmen esnek ve düzensiz kristal ambalaj engel veya elektron yoğunluğu eşlemeleri tamamlanmamış olabilir beri kristalografisi, ya da düşük kaliteli değerlendirmek için zorlu sistemlerdir. Tersine, SAXS çözüm tabanlı ve düşük çözünürlüklü yapısal yaklaşım düzensiz döngüler ve termini özünde düzensiz proteinler12,15,16‘ kadar esnek sistemleri açıklayan yeteneğine sahip olduğunu. Parçacık boyutları12geniş bir yelpazesi ile uyumlu olduğunu düşünürsek, SAXS sinerjik kristalografisi yapısal çalışmaları tarafından ele alınması biyolojik sorular aralığı genişletmek için çalışabilirsiniz.

Bir fonksiyonel ama esnek C-hangi x-ışını kristalografisi yöntemleri için müsait değildir terminus ardından iyi yapılandırılmış bir WD40 etki alanı içerdiği için Nsa1 bir melez yapısal yaklaşım için uygundur. Klonlama, ifade ve arıtma S. cerevisiae Nsa1 x-ışını kristalografisi tarafından hibrid yapısal tayini için ve SAXS için bir protokol aşağıdadır. Bu iletişim kuralı bir arada düzenli ve düzensiz bölgeler oluşmaktadır diğer proteinler yapılarının çalışmaya adapte edilebilir.

Protocol

1. rekombinant Protein üretimi ve Nsa 1 arıtma Nsa1 ifade plazmid tasarım ve klonlama Elde etmek veya S. cerevisiae genomik DNA satın alın. PCR yükseltmek Nsa1 hedef dizisi (Nsa1FL, artıkları 1-463) ve C-terminal kesildi Nsa1 (Nsa1ΔC, artıkları 1-434) S. cerevisiae ve erime sıcaklığını izole genomik DNA’yı kullanarak uygun astar ile yaklaşık 1-2 dk bir uzantısı zaman ile 60 ° C. Aşağıdaki astar Nsa1 yükseltmek için kullanılm?…

Representative Results

Nsa1 S. cerevisiae genomik DNA’güçlendirilmiş ve ardından MBP ve TEV proteaz site bir N-terminal 6 x-histidin benzeşme etiketi içeren bir vektör içine subcloned PCR yapıldı. Nsa1 E. coli BL21(DE3) hücrelere dönüştü ve yüksek verim protein ifade aşağıdaki IPTG ile indüksiyon ve 25 ° c gece (şekil 1A) büyüme elde edilmiştir. Nsa1 benzeşme saf üzerinde immobilize kobalt benzeşme reçine, MBP bölünme TEV proteaz ile…

Discussion

Bu iletişim kuralını kullanan, rekombinant Nsa1 S. cerevisiae gelen yapısal çalışmaları için x-ışını kristalografisi ve SAXS tarafından oluşturuldu. Nsa1 çözümde su kuyusu-davranmak ve kristal yükseltgen kristalize. Bu kristaller en iyileştirme sırasında C-terminus Nsa1, proteaz düşmesine duyarlı keşfedilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Ortorombik kristal formu sadece çoğaltılamaz C-terminal kesme türevleri Nsa1, büyük olasılıkla ile esnek C-terminus Nsa1, kristal ambalaj eng…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kırınım veri Güneydoğu bölgesel işbirliği Access ekibi (SER-CAT) 22-ID ve 22-BM beamlines, Gelişmiş foton kaynak (APS), Argonne Ulusal Laboratuvarı, toplanmıştır. SAXS veri FALCILAR beamline, önceden ışık kaynağı (ALS), Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı üzerinde toplandı. FALCI beamline onların yardımıyla uzak veri toplama ve işleme için personel teşekkür etmek istiyorum. Ulusal çevre sağlık Bilimler Enstitüsü (NIEHS) kütle spektrometresi araştırma ve destek grubu için protein etki alanı sınırları belirleme konusunda yardım için sana şükrediyoruz. Bu eser bize Ulusal Enstitüsü, sağlık Intramural araştırma programı tarafından desteklenen; ABD Ulusal Enstitüsü çevre sağlığı Bilimleri (NIEHS) (R. E. S. için Ziya ES103247) ve sağlık araştırması (CIHR, 146626 M.C.P için) Kanadalı Enstitüleri. APS kullanımı bize Enerji Bakanlığı, bilim Office, Office temel Enerji Bilimler altında Sözleşme No Filtresi tarafından desteklenen yapıldı. W-31-109-Eng-38. Kullanım gelişmiş ışık kaynağı (ALS) Yönetmen, bilim Office, Office temel Enerji Bilimler, Sözleşme No altında ABD Enerji Bakanlığı tarafından desteklenmiştir DE-AC02-05CH11231. Ek destek FALCILAR SAXS beamline Ulusal Sağlık Enstitüsü gelir için project MINOS (R01GM105404) ve bir yüksek-son araçları Grant S10OD018483. Biz de Andrea ay ve Dr Sara Andres Bu el yazması onların eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallel vector Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomic DNA ATCC 204508D-5
Primers for cloning Nsa1
SC_Nsa1_FLFw IDT CGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRv IDT AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFw IDT GGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRv IDT GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells Invitrogen C601003
pMBP- NSA1 and various truncations Lo et al., 2017
Selenomethionine Molecular Dimensions MD12-503B
IPTG, Dioxane-Free Promega V3953
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
Sodium Chloride Caledon Laboratory Chemicals 7560-1-80
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5 KD Medical RGF-3340
Glycerol Invitrogen 15514-029
beta-mercaptoethanol Sigma M6250
1M Imidazole, pH 8.0 Teknova I6980-06
Talon Affinity Resin Clonetech 635503
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) Millipore UFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column GE-Healthcare 28989335
TEV Protease Prepared by NIEHS Protein Expression Core Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels BioRad 456-8056
Crystallization, Proteolytic Screening
Crystal Screen Hampton Research HR2-110
Crystal Screen 2 Hampton Research HR2-112
Salt Rx Hampton Research HR2-136
Index  Screen Hampton Research HR2-144
PEG/Ion Screen Hampton Research HR2-139
JCSG+ Molecular Dimensions MD1-37
Wizard Precipitant Synergy  Molecular Dimensions MD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates TTP Labtech 4150-05823
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506
Proti-Ace Kit Hampton Research HR2-429
PEG 1500 Molecular Dimensions MD2-100-6
PEG 400 Molecular Dimensions MD2-100-3
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 Molecular Dimensions MD2-011-
Sodium Citrate tribasic Molecular Dimensions MD2-100-127
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides Hampton Research HR3-231
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) Hampton Research HR3-172
 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) Hampton Research HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320
Magnetic Crystal Caps Hampton Research HR4-779
Magnetic Cryo Wand Hampton Research HR4-729
Cryogenic Foam Dewar Hampton Research HR4-673
Crystal Puck System MiTeGen M-CP-111-021
Full Skirt 96 well Clear Plate VWR 10011-228
AxyMat Sealing Mat VWR 10011-130
Equipment
UVEX-m JAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo-Fisher
Mosquito Robot TTP Labtech
Software/Websites
HKL2000 Otwinoski and Minor, 1997
Phenix Adams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSAS Petoukhov et al., 2012 https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
Scatter Rambo and Tainer, 2013
Pymol The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC.
BUNCH Petoukhov and Svergun, 2005
CRYSOL Svergun et al, 1995
PRIMUS Konarev et al, 2003
EOM Tria et al, 2015
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
  4. Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells – focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
  5. Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
  6. Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
  7. Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
  8. Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
  9. Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
  10. Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
  11. Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
  12. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
  13. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
  14. Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery – where are we heading next?. Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
  15. Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
  16. Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
  17. Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of “parallel” expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
  18. Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
  19. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  20. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
  21. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
  23. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  26. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  27. McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
  30. Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
  31. Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
  32. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
  33. Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
  34. Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
  35. Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
  36. Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
  37. Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
  38. . The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8 Available from: https://pymol.org (2015)
  39. Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
  40. Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer’s perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
  41. Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
  42. Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
  43. Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
  44. Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
  45. Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
  46. Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
  47. Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).

Tags

X-ray CrystallographySmall Angle X-ray Scattering (SAXS)Structural AnalysisProtein StructureRecombinant ProteinUnstructured RegionsNsa1S. CerevisiaeHybrid Structural AnalysisProtein FunctionProtein DynamicsProtein AggregationPurificationAffinity ChromatographyGel FiltrationSDS-PAGETEV ProteaseCentrifugal Filtration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lo, Y., Pillon, M. C., Stanley, R. E. Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae. J. Vis. Exp. (131), e56953, doi:10.3791/56953 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image