Выделение и характеристика нейтрофилов производные микрочастиц для функциональных исследований
Summary
Здесь описываются новые протоколы изолировать и характеризуют микрочастицы, производные от человека и мыши нейтрофилов. Эти протоколы используют ultracentrifugation, проточной цитометрии и immunoblotting методы для анализа содержания микрочастица, и они могут быть использованы для изучения роли микрочастицы, полученных из различных типов клеток в клеточную функцию.
Abstract
Полиморфноядерных нейтрофилов производные микрочастиц (ПМН)-м/с), липидный бислой, сферические микровезикулы с размерами от 50 до 1000 Нм в диаметре. М/с являются недавно развивается, важной частью ячеек для связи и сигнализации машин. Из-за их размера и характера их выпуска до недавнего времени было игнорировать существование MP. Однако с усовершенствованной технологии и аналитические методы теперь становится их функции в здоровье и болезни. Здесь представлены протоколы направленные на изоляцию и характеризующие ПМН-МПС проточной цитометрии и immunoblotting. Кроме того приводятся некоторые примеры реализации. Эти протоколы для изоляции MP быстрый, недорогой и не требует использования дорогих комплектов. Кроме того они позволяют для маркировки депутатов после изоляции, а также предварительно маркировки источник клеток до выпуска MP, используя проточной цитометрии мембраны конкретных Люминесцентную краску для визуализации и анализа. Эти методы, однако, имеют некоторые ограничения, включая чистоты ПНЛ и депутатов и потребность в сложных аналитических приборов. High-end проточный цитометр необходима для надежного анализа м/с и свести к минимуму ложные положительные читает из-за шума или auto флуоресценции. Описанные протоколы могут использоваться для изоляции и определить биогенеза MP и охарактеризовать их маркеры и изменения в составе различных стимулирующих условиях. Размер неоднородность может быть использована расследовать ли содержание частиц мембраны против exosomes отличается, и ли они выполняют различные роли в ткани гомеостаза. Наконец можно изучить следующие изоляции и характеристика депутатов, их функции в клеточных реакций и различных моделей болезни (в том числе, ПМН ассоциированных воспалительных расстройств, таких как воспалительные заболевания кишечника или острого повреждения лёгких).
Introduction
Недавно, «микрочастицы/микровезикулы» возникая от в цитозоле клеток или плазматической мембраны стали большой научный интерес, как новые данные показывают, что эти структуры, начиная от 50-1000 Нм в диаметре, может нести биологической информации и служить неканонических метод сотовой связи. Иммунной клетки производные м/с, и особенно производимые полиморфноядерных нейтрофилов (ПНЛ) представляют большой интерес, учитывая важную роль ПНЛ в принимающей обороны1,2, воспалительные реакции3и заживление ран 4. до настоящего времени, интригующе, многочисленные доклады показали, про воспалительных и противовоспалительным функции ПМН-МПС5, предлагая потенциальным контекст-, болезни-, видов-и органоспецифическая роль депутатов.
Описанные протоколы в этой связи обеспечивают экономически эффективные, инновационные и адаптируемой метод для изучения функции депутатов в здоровье и болезни. Они применимы для многих модельных организмов, органов и стимуляции условий. Они позволяют для идентификации нескольких типов депутатов и может использоваться в будущем для решения их про воспалительных и противовоспалительными функций. В качестве примера, описанные здесь, как для изучения функции ПМН-депутатов в эпителиальных рану исцеления, в пробирке и в естественных условиях. Представленные протокол для изоляции мыши, костного мозга, полученных ПНЛ был адаптирован с некоторыми изменениями из ранее описанных метод6.
Кроме того, протоколы, описанные в данном исследовании позволяют для обнаружения и определения характеристик определенных маркеров, которые могут быть найдены на ПМН-МПС двумя взаимодополняющими методами: западной помарки и проточная цитометрия. Мы находим, что immunoblotting депутатов, используя стандартные протоколы5 легко и надежно, однако, последние достижения в чувствительность потока цитометрии инструментов и улучшение коэффициента шума на сигнал теперь позволяют для дальнейшего анализа депутатов с помощью этого метода. Описанные протоколы в этом исследовании включать последние достижения и рекомендации от оригинальных научных статей, включая изменения в центрифугирования скорости и времени, помимо условий фильтрации и замораживания/хранения образца7 , 8и как уменьшить «шумы», повысить предел обнаружения ПМН-депутатов и дискриминацию между различными размерами депутатов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом сообщении описываются протоколы изоляции и характеристика ПМН производные депутатов. Для успешного проведения процедуры необходимо учитывать несколько ключевых критических точек. Во-первых ПНЛ должен быть изолирован свежие и используется в экспериментах в течение 2 ч изоляци?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за технической помощи Сваминатана Сучитра доктора, который проходит северо-Фейнберг Школа из медицины потока цитометрии ядро. Финансирование было предоставлено DK101675 (НИЗ).
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
