循環腫瘍細胞を取り込むため医療用ワイヤー線を用いた腫瘍細胞の特性解析: 蛍光抗体法や DNA 魚に基づく 3 D アプローチ

1. 免疫 DNA 2次元 Coverslip の魚 Coverslip の準備、付着細胞播種メモ: は、無菌状態で層流フードの下のすべての次の手順を実行します。 それらを消毒し、100% エタノールに、coverslip を浸します。メモ: 我々 は 12 mm × 12 mm シリコン サポート乗 coverslips (すべての試薬は材料の表で表示) を使用します。 シャーレ (直径 100 mm) に、coverslips を配置します。5 分のための空気の流れを強制乾燥を使用しています。 15 mL 滅菌 1 × ダルベッコ リン酸ペトリ皿の洗浄は生理食塩水 (PBS) バッファー。 10 ml の完全培地のシャーレを洗う (表 1参照)。 種の付着性のセル (FACS 解析では培地、10 mL で約 1,650,000 セルがカウントされます) 優しく均一セルめっき (約 30,000 セル/cm2) を取得するシャーレに細胞懸濁液をドロップします。: 注 〜 70% 合流、付着性の細胞は、少なくとも 48 時間 coverslips に培養する必要があります。 固定・透過注意: アセトンは、可燃性や揮発性物質を刺激です。だけアセトン-抵抗力があるプラスチックまたはガラス容器 (ポリ塩化ビニールまたは PVDF) を使用します。注: 化学の発煙のフードの下でこれらの手順に従います。 使い捨て吸引ピペットを使用して培養液を削除します。 1 × PBS でシャーレを洗います。 ピンセットを使用すると、1 × PBS の 5 mL を含むガラス ビーカーにそれらを浸すことによって、coverslips を洗います。 あぶらとり紙の上 coverslips を乾燥させます。 部屋の温度 (RT) で 10 分間の 100% アセトン溶液に浸漬することによって、上セルを修正します。 ピンセット、coverslip を削除します。5 分間の強制の空気の流れを使用して乾燥 coverslip。注: プロトコルをこの時点で一時停止できます。Coverslip は-20 ° C で保存する必要があります。 蛍光抗体法により 1 日目注: この段階では、夜通しの (O/N) 孵化 (~ 16 h)。 1 × PBS で 2 回、coverslips を洗います。 抗体希釈バッファーの 100 μ L をドロップ (詳細については表 1を参照)、coverslip に室温 30 分間インキュベートし、注: 解決の容積は、全体の coverslip のカバーし、オーバーフローのリスクを回避するために coverslip の表面に基づいて調整必要があります。 準備、1:20 を使用して抗体ミックス (表 1) メーカーが提供するデータシートで指定されている、螢光色素と抗体の希釈バッファー抱合モノクローナル抗体一次抗体の希釈。注: それが強く耐熱性螢光色素を持つモノクローナル抗体を使用するお勧め。非耐熱性の螢光色素を使用している場合プロトコルの DNA 魚手順中温度が螢光色素を損傷し、蛍光の排出を消します。このプロトコルでは、我々 は EpCAM FITC 抗体を選んだ (1:20 希釈)、使用温度に重大な問題が表示されませんでしたが。 1 × PBS で 2 回、coverslips をすすいでください。 上、湿気のある商工会議所とドロップの 100 μ L、上抗体ミックスで coverslips 細胞側に置きます。注意: 解決の容積は全体 coverslip のカバーし、オーバーフローのリスクを軽減する coverslip の表面に基づいて調整する必要があります。 O/N を孵化させなさい (~ 16 h) 4 ° C で暗闇の中で 蛍光抗体法により 2 日目 1 × PBS で 2 回、coverslips を洗浄することにより抗体の孵化をブロックします。注: ストア、coverslips に没頭して暗闇の中で一定の湿度の高い環境で、商工会議所の 4 ° C で 1 × PBS 100 μ L 魚分析が実行されるまで。 2次元 DNA 魚 2 日目注意: 楽器と湿気の多い室内の高温に特別な注意を支払わなければなりません。 ハイブリダイゼーション オーブンと乾熱オーブンを設定 (~ DNA 魚のプロトコルを開始する前に 3 h)。75 ° C でハイブリダイゼーション オーブンを設定、37 ° C で乾燥した熱オーブンを設定、0.4 × SSC ソリューションを冷却 (pH 7.0 ± 0.1 を =) (SSC レシピの表 1を参照してください) 4 ° c注: 魚バッファーの pH 状態は重要です: pH 7.0 ± 0.1 を =。 冷たい 0.4 × SSC ソリューションの 3 回、coverslip を洗ってください。 暗闇の中で 10 分間の化学発煙のフードの下で coverslip を乾燥させます。 10 の渦のプローブ管の壁からのプローブ (最大速度) でダウン クイック スピンを実行します。 スライドとシール ラバー セメントを用いた coverslip のすべてのエッジに魚プローブの 5 μ L のドロップに coverslip の携帯側を置きます。注意: 次の 2 つの手順は、高温を伴います。保護手袋を着用します。 完全な DNA の変性 75 ° C で 8 分間交配のオーブンに暗く湿気のある室にスライドを置きます。 37 で乾熱オーブンに湿気のある部屋に移動 ° C O/n. 2次元 DNA 魚 3 日目 72 ° C で風呂の水を設定し、(表 1) に 0.4 × SSC バッファーとスライド染色の jar ファイルを配置します。30 分後 72 ± である必要があります 0.4 × SSC バッファーの温度を確認 1 ° C 2 つのガラス ビーカーを準備: 2 × SSC + 0.05% トゥイーン バッファーと 1 つ (pH 7.0 ± 0.1 を =) (表 1)、蒸留水で 2 つ目。 湿気の多い部屋をオーブンから取り出し、慎重にゴム セメントをスライドから削除、ピンセットで、coverslip をデタッチします。 72 ° c. で 2 分間 0.4 × SSC を浸すことによって、coverslip を洗う 2 × SSC + 30 0.05% トゥイーン バッファーに浸漬洗浄、coverslip s。 蒸留水の coverslip をすすいでください。 暗闇の中で 10 分間の化学発煙のフードの下で coverslips を乾燥させます。 4´、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 総 DNA の対比染色に 1.5 μ g/mL で液体取付中 coverslip をマウントします。スライドでメディアをマウントの 5 μ L のドロップにダウン coverslip 細胞側に配置、空気を取得し、マニキュアでシール coverslip のピンセットを押します。注意: ミディアム ボリュームのマウントは、coverslip のサーフェイスのサイズに基づいて調整する必要があります。 2 D の顕微鏡観察および分析注: 画像は、別の顕微鏡システムを取得できます。従来の蛍光顕微鏡画像の取得 (材料表) の標準的な商用ソフトウェアに恵まれてを使いました。 12 ビット デジタル カメラと 20 ×/0.50 NA と 40 ×/0.65 NA 目的赤の適切なフィルターを使用してイメージを取得 (励起: 599 nm、発光: 588 nm)、緑 (励起: 509, 発光: 524)、青 (励起: 367 nm、発光: 452 nm) プローブします。 選択のソフトウェア ツールを使用して画像を分析します。注: 蛍光染色と ALK プローブ ローカリゼーションを評価するには、ImageJ を使用しました。スライドは、最大 3 週間の暗闇の中での-20 ° C で保存できます。長期の保管、長期保存用メディアを特定のマウントを使用してをお薦めします。 2. 免疫 DNA ワイヤー魚 セル行スパイクでワイヤー (3 D 対応)注: 予備のセットアップを含む正確な付着性の細胞 EpCAM 積極性に基づいた行。EpCAM 陽性細胞のみが染色できるように修飾はアンチ EpCAM 抗体とワイヤー。注: は、任意の損傷を避けるためにワイヤーの機能の一部を触れないでください。注: すべての手順が無菌状態で層流フードの下で実施している必要があります。 4 mL の完全培; を使用して 5 mL バイアルで T75 フラスコ (80% 合流) の内容全体を再懸濁しますスパイクで単一の約 2,000,000 の細胞はワイヤーへの細胞接着を最大限に推奨します。 ガラス パッケージからワイヤを削除します。 バイアルにワイヤの官能の金色の部分を浸し、バイアルに適したワイヤー ストッパーは、水密を確保します。研究室のフィルムでシールします。注: ワイヤー ストッパーとバイアルの正しい一致を許可するには、5 mL チューブの使用の使用をお勧めします。 チューブ回転の RT で 30 分間インキュベート (0-120 角)。 3 の異なるクリーン バイアルを使用して 1 × PBS 溶液中線 3 回をすすいでください。 固定・透過注意: アセトンは気道を刺激することができる可燃性物質です。アセトン-抵抗力があるプラスチックまたはガラス容器 (ポリ塩化ビニールまたは PVDF) のみ使用します。注: 化学の発煙のフードの下でこれらの手順に従います。 ワイヤーを風乾します。 5 mL チューブ ルート使用で 10 分のアセトン 100% 溶液でワイヤを浸漬によってセルを修正します。注: ワイヤー ストッパーでする必要があります、定着剤は接触しません。 室温 5 分用のワイヤーを風乾します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。ワイヤーは、-20 ° C で保存されなければなりません。長期保存用のワイヤーをパッキング、官能の先端の横にワイヤー ストッパーを置き、慎重に官能の先端を傷つけないように世話ストレージ ガラス管にワイヤを挿入します。ストレージ ・ ガラスを閉じ、-20 ° C で (垂直方向または水平方向) を保管 蛍光抗体法により 1 日目注: この段階では、O ・ N インキュベーション (~ 16 h)。 5 mL のチューブを使用して 1 × PBS ソリューションで 2 回洗います。 5 mL チューブを用いた RT で 30 分の抗体希釈バッファーにワイヤを孵化させなさい。 抗体希釈バッファー、データシートで指定されている蛍光色素標識モノクローナル抗体の一次抗体の希釈抗体ミックスの 150 μ L を準備します。たとえば、EpCAM FITC 抗体は、1:20 で使用された希釈。 P200 ヒントを使用して、培養を次のように実行する: ワイヤー ストッパーから線を抽出し、先端の大きな穴を介してワイヤをそっと挿入します。最初 unfunctionalized の先端を挿入し、金色の部分は大きな穴の向こうまで、小さい穴を通してワイヤーをゆっくりと引き出します。 抗体ミックスの 150 μ L をゆるやかに降下 (たとえば抗 EpCAM_FITC 抗体 1:20 希釈) 先端に。バブル形成のリスクを避けるためには、機能の一部は、完全に陥ってまで、ゆっくりワイヤーをクルクル回します。 シールは、先端の穴をアップします。穴の周りラップ研究室フィルムができます。 インキュベート垂直 O/N (~ 16 h) 4 ° C で暗闇の中で 蛍光抗体法により 2 日目 ワイヤーを 1 × PBS で 2 回洗浄することにより抗体の孵化をブロックします。 そのワイヤー ストッパーでワイヤーを挿入し直します。注: 1 の店で 4 ° C 5 mL の 1x PBS バイアル魚分析が実行されるまで。 3 D DNA 魚 2 日目注意: 楽器と湿気の多い室内の高温に特別な注意を支払わなければなりません。 ハイブリダイゼーション オーブンと乾熱オーブンを設定 (~ DNA 魚のプロトコルを開始する前に 3 h)。75 ° C でハイブリダイゼーション オーブンを設定、37 ° C で乾燥した熱オーブンを設定、0.4 × SSC ソリューションを冷却 (pH 7.0 ± 0.1 を =) 4 ° c注: 魚バッファーの pH 状態は非常に重要です、7.0 ± 0.1 をする必要があります。 冷たい 0.4 × SSC ソリューションの 3 回ワイヤーを洗ってください。注: は、次の手順の中に螢光色素退色を避けるために暗闇の中の配線をしてください。 シリカフューム戸棚の下で暗闇の中で 10 分間乾燥させます。 渦とスピン 5 プローブ s。 屈伏チューブにプローブの 10 μ L をドロップします。研究室のフィルムでカバーします。 次のように、チューブをスピン: 50 mL チューブに乾燥吸水性、紙入れで、チューブをラップし、簡単にスピンします。 慎重に配置したマイクロ チューブに乾燥のワイヤー、ワイヤー ストッパーを挿入します。ゴム系をシールします。注意: 次の 2 つの手順は、高温を伴います。保護手袋を着用します。 完全な DNA の変性を取得する 75 ° C で 8 分間交配のオーブンに暗く湿気のある商工会議所に線を入れてください。 37 で乾熱オーブンに湿気のある部屋に移動 ° C O/n. 3 D DNA 魚 3 日目 水お風呂に 0.4 × SSC ソリューションの瓶を染色スライドを配置し、72 ° C で設定 まで 72 ± 0.4 × SSC の液温をチェック 1 ° C 2 つのガラス ビーカーを 2 × SSC + 0.05 %1 つの準備トゥイーン (pH 7.0 ± 0.1 を =) ソリューションと 2 つ目の蒸留水します。 乾熱オーブンから湿気のある商工会議所を取り出し、ワイヤー ストッパーからゴム セメントを丁寧にピンセットを使用して、線を取る。注: は、官能の先端を傷つけないように注意しながらのストッパーを介してワイヤの光沢の終わりを慎重に引き出します。 72 ° c. で 2 分間 0.4 × SSC ソリューションにディップします。 2 × SSC + 0.05% トゥイーン向け 30 の線を洗って室温 s 室温の蒸留水でワイヤーを洗う 暗闇の中で 10 分間ヒューム フードの下でワイヤーを乾燥させます。 DAPI の原液 2 ml 1 × PBS の 1.43 μ m を準備します。 右で暗闇の中 1 h の 2 mL バイアルに DAPI 溶液でワイヤーの官能の先端を孵化させなさい 1 × PBS で 2 回ワイヤーをすすいで空気乾燥します。 3 D 顕微鏡観察および分析 ワイヤーのホルダーにワイヤを配置します。慎重に先端に結合点が一致するまで特別なホルダーのエントリ ポイントを通じて機能のヒントを挿入します。機能性のヒント (図 1 a) を傷つけないように注意します。 顕微鏡ステージ上には、特別なホルダーを取り付けます。20 × レンズを使用して顕微鏡の焦点を調整します。まず特別支援に焦点を粗く、DAPI チャネルで明るく表示されているセルを細かく調整します。 だけ入れてフォーカス セル レンズの中心。注: 画像は、別の顕微鏡システムを取得できます。この設定では、従来の蛍光顕微鏡画像の獲得のための標準的な商用ソフトウェアに恵まれているを使用します。 12 ビット デジタル カメラと 20 ×/0.50 NA と 40 ×/0.65 NA 目的赤の適切なフィルターを使用してイメージを取得 (励起: 599 nm、発光: 588 nm)、緑 (励起: 509, 発光: 524)、青 (励起: 367 nm、発光: 452 nm) プローブします。注: 画像は、さまざまなツールやソフトウェアを使用して視覚化できます。我々 は, 免疫蛍光染色と ALK プローブ ローカリゼーションを評価するのに ImageJ を使用します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。ワイヤーは、-20 ° C で保存されなければなりません。長期保存用のワイヤーをパッキング、官能の先端の横にワイヤー ストッパーを置き、慎重に官能の先端を傷つけないように世話ストレージ ガラス管にワイヤを挿入します。ストレージ ・ ガラスを閉じ、-20 ° C で (垂直方向または水平方向) を保管