تحديد خصائص الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط تعميم الخلايا السرطانية: نهجاً ثلاثي الأبعاد استناداً إلى الفلورة والأسماك الحمض النووي
Summary
نقدم نهجاً جديداً لتمييز الخلايا السرطانية. نحن جنبا إلى جنب الفلورة مع الحمض النووي فلوري-في الموقع-التهجين تقييم الخلايا التي استولت عليها سلك طبي فونكتيوناليزيد قادر على في فيفو إثراء ريادية مباشرة من دم المريض.
Abstract
تعميم خلايا الورم (ريادية) ترتبط مع بقاء الفقراء في السرطان المنتشر. التحديد، فينوتيبينج، والتنميط يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل لعدم تجانس الورم ومما يسهل اختيار المرضى للعلاج شخصية. ومع ذلك، وهذا يعوق بسبب ندرة ريادية. نقدم نهجاً مبتكراً لأخذ العينات حجماً كبيرا من دم المريض والحصول على معلومات عن إزفاء الوجود والنمط الظاهري والجيني ريادية. الأسلوب يجمع بين تلطيخ الفلورة والحامض النووي فلوريفي الموقع-التهجين (الحمض النووي الأسماك) ويستند إلى سلك طبي فونكتيوناليزيد. هذا السلك هو جهاز مبتكرة التي تسمح بالعزل في فيفو ريادية من كمية كبيرة من الدم المحيطي. حجم الدم فحص الإدارة 30 دقيقة من الأسلاك هو حوالي 1.5-3 ل. لإثبات جدوى هذا النهج، تم تحديد التعبير (ابكام) جزيء التصاق الخلايا الظهارية وازفاء الجينات كيه في الرئة الخلية الصغيرة غير خطوط خلايا السرطان (NSCLC) استولت عليها أسلاك فونكتيوناليزيد و الملون بنهج أسماك المناعية-الحمض النووي. وكان التحدي الرئيسي الذي نواجهه للقيام الفحص على هيكل ثلاثي الأبعاد، سلك فونكتيوناليزيد، وتحديد النمط الظاهري المناعية وإشارات الأسماك على هذا الدعم باستخدام مجهر الأسفار تقليدية. النتائج التي تم الحصول عليها تشير إلى أن اصطياد ريادية وتحليل النمط الظاهري، وإعادة ترتيب الكروموسومات يمكن أن يحتمل أن تمثل نهج تشخيص رفيق جديد وتقديم مبتكر شخصية استراتيجية لتحسين علاج السرطان.
Introduction
ريادية تمثل خطوة رئيسية من سرطان الخلية نشر1. وجودها في الدم المحيطي لدى المرضى مقترن (المنتشر) الانتكاس والمرض تطور2،3. عزل الإرهاب وتوصيف من الدم لمرضى السرطان نوع من خزعة سائلة غير الغازية. وفي السنوات الأخيرة، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن رصد التقدم واستجابة الأورام للمعالجات المختلفة باستخدام هذا النوع من التحليل يوفر المعلومات السريرية الهامة4،5. خزعة السائل أكثر فائدة عندما الجراحة ليس ممكناً أو عندما لا يتوفر أنسجة الورم الرئيسي، أيلآفات غير بيوبسيابل. ومن ثم فإن هذا النهج واعدة في إعدادات معينة من السرطان مثل NSCLC المنتشر، حيث ثبت وجود ريادية ل دور سلبي الذي تنبؤاتها6. NSCLC هو ورم أن يستفيد خصوصا من النهج العلاجية المستهدفة7،8،9 مصممة لتعمل على جزيئات معينة (الأهداف الجزيئية) المعروفة للمشاركة في النمو والتقدم، و انتشار هذا المرض. ومن ثم، هناك حاجة إلى الكشف عن أهداف محددة أثناء تطور المرض. التحقيق لجنة مكافحة الإرهاب نهج تشخيص للاهتمام للغاية لكشف ورصد أهداف المخدرات دون الحاجة للأنسجة الأولية أو المنتشر. على سبيل المثال، الكشف عن كيه الجينات المولدة في الخلايا NSCLC يرتبط بحساسية كريزوتينيب، علاج مستهدفة محددة10. ومع ذلك، في الوقت الحاضر، يتم تنفيذ الكشف عن المولدة كيه فقط على تبين إبرة غرامة أو الخزعات الصغيرة؛ نتيجة لذلك دون وجود ورم الأنسجة كيه التحليل لا يمكن. ريادية هي بديل محتمل للورم التحقيقات المستندة إلى الأنسجة، وتمثل نهج تشخيص رفيق واعدة جداً.
على الرغم من أهميتها المحتملة، ريادية لا تزال موضوع جدل كبير بين البحوث، أساسا بسبب هذه الندرة (1-10 خلايا/مل من الدم المحيطي11). الحالي خزعة سائلة أساليب استخدام كمية محدودة من الدم (أي، 1-30 مل)12،13، ولكن هذا يخلق حالة حساسية دون المستوى الأمثل للكشف عن ريادية. وبالتالي، يبرر البحث لإيجاد النهج وتطوير الأجهزة لإجراء خزعات السائلة التي تستهدف مكافحة الإرهاب على حجم أكبر من الدم المحيطي.
جهاز بديل، سلك طبي فونكتيوناليزيد (انظر الجدول للمواد)، وقد وضعت للتغلب على أوجه القصور في أخذ عينات الدم والحصول على إجراء تحليل أكثر تمثيلاً ريادية. هذا السلك فونكتيوناليزيد هو جهاز طبي وافقت CE يلتقط ريادية مباشرة من مجرى الدم ل مرضى السرطان1. وهو يتألف من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ طوله 16 سم (الشكل 1a) مع تلميح فونكتيوناليزيد طوله 2 سم مغطاة بطبقة سمكها 0.2 ميكرون من الذهب. الطبقة بدورها تغطي طبقة المائية 1 إلى 5 ميكرومتر سميكة بوليكاربوكسيلاتي تساهمي مقترنة بالأجسام المضادة الموجهة ضد ابكام، أحد المستضدات المعرب عنها على نطاق واسع على سطح ريادية14. نصيحة فونكتيوناليزيد من الأسلاك هو عرض في الوريد من ذراع المريض، ولا تزال في موقف لمدة 30 دقيقة على الأقل. ويسمح هذا النهج عزل ريادية المجراة، مباشرة في الدم المحيطي، والشاشة حوالي 1.5-3.0 لتر من الدم (حوالي 300-fold أكثر من وحدة التخزين المستخدمة للنهج البديلة)1.
بانتيل وآخرون. أثبتت فعالية هذا النهج في عزل ريادية في عروق الذراع ل مرضى سرطان الرئة15مباشرة. فأدوا الفلورة سلك تلطيخ تحديد ريادية باستخدام الأجسام المضادة التقليدية الموجهة ضد عموم-سيتوكيراتين، ابكام و CD45 للكشف عن ليوكوسيتي. وكان فحص الأسلاك تحت مجهر الأسفار ضوئية15. أثبت المؤلفون أن الجهاز قادراً على عزل ريادية، إلا أنها لم تحقق أي من الأهداف المتصلة بالعلاج، مثل كيه المولدة.
طريقة عرض يهدف إلى تحديد ريادية المفترضة في خطوط الخلايا NSCLC استناداً إلى معلمات الشكلية، مثلاً، ابكام الإيجابية، ووجود المؤشرات الحيوية الجزيئية، على سبيل المثال مركز كيه (الشكل 1b). يجمع هذا الإجراء استغرقت 3 أيام بين أسلاك فونكتيوناليزيد والفلوره تلطيخ مع الحمض النووي fluorescenceفي الموقع-التهجين (الحمض النووي الأسماك)، يدعى المناعية-الحمض النووي-الأسماك. نظراً لأن ريادية كيانات نادرة، الاستفادة من هذا البروتوكول أنه يمكن وصف ريادية في نفس السلك من حيث الميزات إيمونوفينوتيبيك والحمض النووي ترتيبات جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة، لأول مرة، أسلوب الجمع بين تلطيخ الفلورة و “الأسماك الحمض النووي”، للاستخدام مع السلك فونكتيوناليزيد اقترح. تم استدعاء الأسلوب “الأسماك” المناعية-الحمض النووي. ووضعت هذه التقنية تسمح تحديد المتزامن ريادية المفترضة على سلك 3D على أساس المعايير الشكلية، مثل الإيجابية إلى ابكام (الحدث 1)، وتيسير الكشف عن التعديلات الجزيئية، مثل (مركز الجينات كيه الحدث 2). تحديد واحد من هذين الحدثين يتيح الكشف عن تلك الترجمة المشارك. ومن ثم، يمكن تكييف هذا النهج تحديد وتوصيف ريادية استردادها من الدم لمرضى السرطان. الآثار المحتملة حمو-مكونات والكريات البيضاء في الإجراء المصبوغة لا تتدخل عادة في الإجراء. على وجه الخصوص، أشارت البيانات المبلغ عنها في الأدب إلى أن هايمو-مكونات والكريات البيضاء لا تؤثر الفلورة تلطيخ الخلايا المرفقة إلى الأسلاك، خطوة حاسمة لتحديد1،ريادية الفعلي15.
سطوع fluorescence الأسماك المناعية-الحمض النووي ملحوظ أقل قليلاً من إيمونوفوتوتيبينج التقليدية الاعتداء ونتيجة لدرجة الحرارة العالية اللازمة لفحص الأسماك. ومع ذلك، الفلورة تلطيخ لا يزال ملموسا. على سبيل المثال، إشارة باهتة قابلاً للاكتشاف لا يزال في خط الخلية معربا عن ابكام منخفضة، NCIH1975. درجة الحرارة العالية اللازمة لفحص الأسماك هو العامل الرئيسي الذي يحد في اختيار fluorochrome الحق ترتبط الجسم. في هذا البروتوكول، يجب ربط الأجسام المضادة فلوروتشرومي الحرارة من أجل تحمل درجة الحرارة تمسخ الحمض النووي. على سبيل المثال، فيكوريثرين، فلوروتشرومي ثيرموسينسيتيفي، غير مستحسن في هذا الإعداد بسبب تدهور فلوروتشرومي بسبب ارتفاع درجة الحرارة. Fluorescein isothiocyanate هو خيار جيد و fluorochrome المشتركة كثيرا ما يعملون في تحقيقات الأسماك. إشارة أوتوفلوريسسينسي “الأسماك” المناعية-الحمض النووي ضعيف للغاية على يدعم 2D القياسية. على دعم الأسلاك، طبقة البوليمر قد حمل إشارة طفيفة أوتوفلوريسسينسي، لا سيما في القناة الحمراء. على عكس الخلفية 2D، إشارة خلفية أسبيسيفيك ملحوظ على السلك لكن لا تؤثر تأثيراً كبيرا على توصيف الهوية أو خلية الأنوية.
مجهر التقييم من الأسلاك فاتيجوينج أكثر بكثير مما في 2D دعم بسبب حدود المجهر البصري في القراءة على السطح من بنية ثلاثية الأبعاد على شكل أسطواني. ومع ذلك، يمكن التغلب على هذه الصعوبة بالتناوب صاحب الأسلاك، والحصول على الصور التي يتم ترجمة أساسا على طول خط الوسط الأسلاك. حامل سلك يسمح بدوران 360 درجة للأسلاك. مرة واحدة تركز على الأنوية، تغيير القنوات الأسفار ليس بالضرورة الحفاظ على التركيز في المنطقة المستهدفة. ولهذا السبب، من الضروري للحفاظ على التركيز على المنطقة الداخلية-الخلية المستهدفة.
ويمكن تكييف هذه التقنية لكشف وتوصيف الخلايا في أنواع مختلفة من يدعم 3D. كما قد يكون من الممكن استخدام الأجسام المضادة المختلفة ويَسْبِر الأسماك. عند اختيار استخدام الأجسام المضادة المختلفة، ثبات فلوروتشرومي ومستوى التعبير مستضد المستهدفة في غشاء الخلية من العوامل الهامة للنظر. يمكن أيضا أن تكون الملون المستضدات داخل الهيولية. عند استخدام الأسماك المختلفة تحقيقات، من المهم التحقق من مواصفات ورقة البيانات للإجراء تمسخ وإعداد الخلايا للأسماك الاعتداء عليه.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
| Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
| BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
| Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
| RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
| Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
| RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
| L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
| H20 | MilliPore | ||
| XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
| DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
| EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
| Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
| Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
| STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
| SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
| ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
| Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
| Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Xu, W., et al. Comparison of three different methods for the detection of circulating tumor cells in mice with lung metastasis. Oncol. Rep. , 1-8 (2017).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci. Rep. 7 (February), 43424 (2017).
- Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer. Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).
- Toss, A., Mu, Z., Fernandez, S., Cristofanilli, M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann. Transl. Med. 2 (11), 108 (2014).
- Wang, J., Huang, J., Wang, K., Xu, J., Huang, J., Zhang, T. Prognostic significance of circulating tumor cells in non-small-cell lung cancer patients: a meta-analysis. PLoS One. 8 (11), e78070 (2013).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or Chemotherapy for Non?Small-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR. N. Engl. J. Med. 362 (25), 2380-2388 (2010).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK -Positive Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 368 (25), 2385-2394 (2013).
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Costa, D. B., et al. Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases. J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).
- Fischer, J. C., et al. Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).
- Coumans, F. A. W., Ligthart, S. T., Uhr, J. W., Terstappen, L. W. M. M. Challenges in the enumeration and phenotyping of CTC. Clin. Cancer Res. 18 (20), 5711-5718 (2012).
- Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).
- Theil, G., et al. The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes – A proof-of-concept study. PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
