洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

1. 膜融合の準備の SUV とマブラヴ 融合ペプチド脂質混合物の調製 25-50 mg/mL のクロロホルムで中立的な蛍光アニオン性、カチオン性脂質の貯蔵液の準備 (たとえば、中立ダイレクトオン (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、カチオン エチル-PC (1, 2-dimyristoleoyl-sn-グリセロホスファチジン-3-ethylphosphocholine)、アニオン ポパ山 (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) と、蛍光コレステリル-Bodipy-FL12、それぞれ)、乾燥脂質の適切な量を計量し、100% 溶解クロロホルム (注意!これを行うヒューム フードの下で)、または市販のクロロホルム クロロホルムと脂質の株式を希釈します。注: 両方自然な脂質を抽出し、純粋な合成脂質使用ことができ、同様の結果を示します。 ミックス 2.5 mg、カチオンとクロロホルム在庫 (1.1.1) ガラス瓶の中性脂質 2.5 mg。注: この手順は、クロロホルム、カチオン性脂質の重量分率を 50% を含むカチオン性脂質混合物の 5 mg を得られます。必要な場合は、混合物に蛍光脂質の重量分率を 0.5% を追加します。 陰イオンと中性脂質はガラス瓶でクロロホルム株 (1.1.1) 4 mg 1 mg を混ぜます。これは、アニオン性の脂質混合アニオン性脂質の 20% の重量割合の 5 mg を与えます。 乾燥脂質の薄い層を形成する窒素の流れの下でクロロホルムを蒸発させます。 10 分間の真空下で残留のクロロホルムを削除します。注: この手順が多く長く (1-12 h) を実行する伝統的が長く治療な結合特性 SUV で明白な改善はないことがわかった。 各バイアルに 0.5 mLバッファー A (100 mM KCl、1 mM MgCl2、50 mM モップ、pH 7.4) を追加すると、脂質膜がガラス表面と b から完全に切り離されてまで 30 分、次に渦の室温に立つように残して乾燥脂質膜を水和物します。ecomes 均質な脂質懸濁液。これほどかかります 20-40 秒。 押出形成 SUV とマブラヴ 押出成形システムを構築 (材料表参照) 次のポリカーボネート フィルターを用いて 1 mL 注射器 2 本孔サイズ: フォーム SUV、100 または 200 nm とマブラヴのフォームに 400 または 800 nm。 脂質懸濁液を注射器に転送します。 渡すことによってフィルターを 21 倍、18,19を他の所で示すように、懸濁液を押し出します。注: 通路の数が奇数は、元脂質懸濁液に直面しているフィルター側に付く大きな脂質塊の小胞のソリューションに転送を最小限に抑えるために必要です。 1.5 mL 遠心チューブに小胞ソリューションを転送します。 2. 融合性逆エマルジョン法による GUV の形成 注: この手順は図 2に示されています。 脂質の油溶液の調製 クロロホルム株式をミックス (1.1.1 手順参照) の中性脂質 (2 mg) と 1.5 mL 遠心チューブにヘキサデカンの 1 ml のアニオン性脂質 (0.5 mg)。 [一定の混合と管が開いたまま 30 分 80 ° C で加熱混合物からクロロホルムを蒸発させます。チューブを閉じ、室温に涼しい許可しなさい。 脂質-で-油/水性バッファー インターフェイス脂質単分子膜の形成 0.5 mLバッファー B 1.5 mL 遠心管 (20 mM KCl、0.1 mM MgCl2、10 mM モップ pH 7.4) の上に油の脂質ソリューションの場所 200 μ L。油と (図 2 a) 緩衝水溶液の表面張力不一致による相分離境界線の凸形状に注意してください。 相分離境界線を平坦化、脂質単分子膜形成の指標であるまで待機します。これは通常室温で 30-60 分をかかります。 水-油エマルションの調製 バッファー B、密度が水の密度よりも高い水溶性の非イオン性多糖類の溶液を準備 (例えば15% Ficoll 400 (w/v) を密度 1.05 g/mL)注: 必要に応じて、1 つに追加できます蛍光水溶性色素、旦那のより良い視覚化のためのバッファーと、膜の他の目的水溶液内容。 2.1.2 から脂質の油溶液の 100 μ L で別 1.5 mL 遠心チューブに液 0.5 μ L を転送します。 30 の混合物 (14 W で 44 kHz) を超音波超音波水浴の s。その後、各液滴を脂質単分子膜 (図 2 b) コーティングされます水-油エマルションを形成する 45 分間渦精力的に。 水-油エマルションの旦那への変換 脂質-で-油/水性インターフェイス上に結果エマルジョンを置き、すぐに 10,000 x g で 2 分間のテーブル トップ遠心チューブを遠心します。旦那の結果ペレットは明確に表示されます (図 2) をする必要があります。 冷却油の脂質混合物を固めるために冷蔵庫で 4 ° c 管 (図 2 D、ヘキサデカン凝固 18 ° C 以下)、慎重に冷凍の油分し、し、水性相を撤回します。注: 石油を容易にするには、ワイヤーはアンカーの形に曲がって削除凍結が使用されました。 新鮮なバッファー B、新鮮なチューブへの転送の 50 μ L で GUV ペレットを再懸濁します、100 × 油浸対物 (図 2 e) を使用して蛍光顕微鏡下で検査します。 3. コバルト カルセインを用いた小胞の融合 ゲルろ過重力列の準備。 100 mL の脱イオン水にゲル濾過の樹脂 (例えば極細セファデックス G-50) ~ 10 g を浸漬し、うねりの一晩を聞かせてください。 使い捨てプラスチック重力流列に樹脂の 3 mL のパックや、超純水で洗浄バッファー C (100 mM KCl、10 mM モップ、pH 7.4) 室温で平衡します。 SUV+または SUV0の準備は、コバルト カルセインを搭載しました。 カルセイン 1 mM、1 mM CoCl2, 98 mM の NaCl、10 mM モップを含む溶液を調製し、pH を 7.4 にもたらします。メモ: メソッドの本質は、その無料蛍光カルセインと Co2 +非蛍光性の複合体を形成します。それが持つ EDTA の添加によって再び蛍光になる高い親和性 Co2 +、コバルト カルセイン コンプレックス (図 3 a) からカルセインを転置します。 1.1 で説明されている陽イオン性または中性脂質のドライ フィルムにこのソリューションの 500 μ L を追加します。 準備 100 nm SUV 押出し 1.2 で説明されているようで。 卓上型超遠心機で 20 分間 1,000,000 x g で押し出しの SUV をペレットし、1 mL のバッファー Cで再懸濁します。巻き上がり・ ペレット化を繰り返して、3 回;最後の再懸濁の 0.6 mL のバッファー C を使用します。注: これらの手順は、外部のコバルト カルセインのほとんどを削除します。 3.1.2 のステップのとおりバッファー C と平衡ゲル濾過樹脂搭載使い捨て重力流列を SUV を通過して残りの外部コバルト カルセインを削除します。注: 我々 は通常フローからの最初のミリリットル ボリュームを破棄し、外部コバルト カルセイン無料 SUV を含む 2 番目のミリリットルを収集します。 EDTA 搭載 SUV-の準備 10 ミリメートルの EDTA、80 mM の NaCl、10 mM モップ、pH 7.4 のソリューションを準備します。 1.1 で説明されている陰イオンの脂質のドライ フィルムにこのソリューションの 500 μ L を追加します。 押出し 1.2 に従って SUV-を準備します。 ペレットし、前述の 3.2.4 で SUV-を再懸濁します。 3.2.5 で説明するようゲルろ過カラムを SUV-を渡すことによって残りの EDTA を削除します。 SUV の融合に向けてください。 SUV0、+の SUV と-の SUV とバッファー D (1 mM モップ、pH 7.4) 0.2 ミリメートル CoCl2と KCl 使用 5 μ L バッファー + の 1 mL あたりの SUV の種類ごとの必要な濃度と補われるを希釈します。 少なくとも 1 h の混合物を孵化させなさい。注: この手順は、+の SUV に表面バインドされたカルセインをブロックすることによってバック グラウンド蛍光レベルを最小限になります。 小胞の融合 2 mL 蛍光キュベットと 480 nm 励起と 510 nm の発光を用いたカルセインの蛍光を増加モニター SUV− (D 前述のバッファーで希釈) 1 ml SUV+または SUV0の 1 mL を混合することによって核融合反応を開始します。(図 3 b)。 反応が完了するまで待機します。 洗剤のトリトン X-100 と EDTA の混合物を追加 (最終濃度が 0.05% と 7 mM のそれぞれ) 小胞からカルセインを解放し、最大蛍光信号を取得します。 融合を図 3に示すように、次の洗剤を追加最大蛍光信号の割合として定義の範囲を決定します。 4 膜融合プロテオリポソームに膜タンパク質の高速再構成 注: この手順は、図 4 aに示します。 ゲル濾過樹脂、3.1 で述べたように重力流列を準備し、バッファー A 室温で平衡します。注: タンパク質活性の損失を最小限に抑えるため、指示がない限り、すべてのそれ以上の操作は≤ 4 ° C で厳密に行う必要があります。 蛋白質の隔離に使用する同じ抽出バッファーで希釈して 0.7 mg/mL に精製された膜タンパク質の濃度を調整します。 前もって形成された SUV、160 μ L バッファー、バッファー A に, コール酸 10% の 60 μ L 300 μ L 蛋白質のミックス 140 μ Lこれは 1:30 を与える蛋白質: 660 μ L の大詰めで脂質の重量比。 軽く 15 分ロッキング プラットフォームの混合物を振る。注: 次の手順は、室温で行うことができます。 ゲルろ過樹脂を通して混合物を渡すプロテオリポソーム濁った分画を収集しています。 15 分 400,000 × g で卓上型超遠心機とプロテオリポソームをペレットします。 再構成された非蛋白質を含んでいる上澄みを廃棄し、新鮮なバッファー A. の 1 mL にペレットを再懸濁します PL とアミド ブラック法20を使用して上清タンパク質含有量を決定します。 通常は 50-70% の再構成、収量を決定します。注: 手順 4.6 4.8 は、1 mL の Ni NTA 樹脂使い捨て重力列にパックし、バッファー A で洗浄した 3.1.2 で説明されているようで、PL ソリューションを渡すことによって必要に応じて置き換え可能性があります。このような通過非再構成のタンパク質は、最もは流れであるが、PL から樹脂に優先的にバインドされますが挿入されます。 5 プロテオリポソームの蛋白質の活動の機能テスト 注: 本研究で使用される両方の蛋白質は、強力なプロトン ポンプは、ポンプの基質の添加によってプロテオリポソームに H+ (コエンザイム Q1ボー3-酸化酵素と ATP F1Foのそれぞれ)、従って建物膜 (ΔpH) の間でプロトンの勾配。融合による成功共同再構成の場合そのような酸性化、pH に敏感なプローブ ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15、このようなタスク (のために日常的に使用される蛍光性の減少として観察できます。図 4BC)。さらに基質特異的蛋白質の活動 (bo3コエンザイム Q1酸化-オキシダーゼ22と F1Fo23,24による ATP 加水分解) 監視することができます光光度法によるさまざまなメソッドを使用します。ここでは、F1Fo二法 (図 4) を再生成する分子の ATP を使用して PL の ATP 加水分解活性を示す酵素 (ピルビン酸キナーゼ (PK) と乳酸脱水素酵素 (LDH) 維持 ATP 濃度が一定以下のようにします。PK では、ADP プロデュース F1Foその基板ホスホエノールピルビン酸 (PEP) を犠牲にして ATP に変換することによって ATP がリサイクルされます。340 の光学濃度が小さくなるよう、酸化を監視できる NADH を犠牲にして LDH によってこの反応の産物であるピルビン酸は乳酸に変換されます nm。 化学薬品の準備 1 mM のエタノールの ACMA 在庫を準備します。 エタノールで nigericin の 1 mM の在庫 (または他のランプ) を準備します。 エタノール、25 mM はコエンザイム Q1在庫およびバッファー A. の 1 M DTT 在庫を準備します。 100 mM ATP バッファー A の在庫を準備し、その pH 7.4 に調整します。 A: 100 mM PEP バッファー、1 mM NADH および 500 〜 1,000 の濃度で PK と LDH のソリューションでのシステム コンポーネントを再生成する ATP の在庫の準備ユニット/mL。 コエンザイム Q1酸化駆動プロトン ボー3ポンプ-オキシダーゼ PL 0.5 μ M、ACMA の存在で 2 mL バッファー A 蛍光キュベットに PL の 20 μ L を追加し、430 nm 励起と 515 nm の発光を使用して安定した信号を待ちます。 キュベットに 40 μ M コエンザイム Q1を追加します。 プロトン ポンプ (図 4 b) の PL に 2 mM DTT を追加することによって開始します。注: DTT 酸化型コエンザイム Q1を減らすし、ボー3にできるようになります-酸化酵素。 2 μ M ランプ (たとえば nigericin) を追加することによって形成された ΔpH を散らします。ACMA 蛍光信号はほぼ元のレベルにすぐに返す必要があります。注: 必要がありますない ACMA は基質の添加によって焼入、ランプが最初反応混合物の存在する場合。 ATP 加水分解駆動プロトンが F1FoPL でポンプ 蛍光キュベット 5.2 で説明されているように、PL の 40 μ L を追加します。 プロトン ポンプ 0.2 mM ATP を PL (図 4) に追加することによって開始します。 5.2.4 で説明したように、ΔpH を消費します。 F1FoPL と、ランプによる促進による ATP 加水分解 2 mL バッファー A、含んでいる 1 mM ATP 0.2 mM NADH, 2 mM PEP と分光光度計のキュベットに PL の 40 μ L と 15 μ L 各 PK と LDH の追加します。 340 NADH の吸光度の減少を測定することによって反応に従う nm。3 〜 4 分は後で、ATP 加水分解に対する ΔpH の背圧を解放するためのキュベットに 2 μ M ランプを追加します。反応速度はすぐに増やす必要があります。メモ: Ni NTA 樹脂 4.10 に従って通過 PL ランプ (図 4、赤いトレース) による最強の刺激デモンストレーションを溶出液はほとんど刺激 (ブルー トレース) になります。 6. 膜融合プロテオリポソームの膜タンパク質の機能に及ぼす脂質環境およびイオン強度の影響をテストします。 40 μ L のプロトン ポンプを評価+の PL、PL- 、2 mL の ACMA 焼入法と PL0のバッファー 1 mM MgCl2と 20 (図 5、パネル A) 100 mM KCl (パネル B) 5.2 または 5.3 (図 5で説明したように補われる D、赤、黒、青のトレース)。 PL+の 40 μ L を 2 mL のバッファー D 20 mM KCl、ACMA 焼入 (緑トレース) のテストと補完でマブラヴ-の同じボリュームに融合します。 PL と同じ料金 (グレー トレース) の SUV を混合して、ステップ 2 のように制御実験を実行します。注: は、postfusion の PL によって改善されるべきプロトン ポンプ 7. マブラヴと膜融合プロテオリポソームで旦那に膜タンパク質の配信 800 の 50 μ L で PL+の 50 μ L をヒューズ 1 mL のバッファー 1 mM MgCl2と 5 分の 20 mM KCl を添加した D でマブラヴ- nm。 5 分間 6,000 x g で小胞ペレット、上澄み含む未反応 PL+を破棄します。1 mL のバッファー 1 mM MgCl2と 100 ミリメートル、KCl を添加した D でペレットを再懸濁し、ペレット化と再 2 回以上繰り返します。 5.2 または 5.4 で説明したように、アッセイを焼入れ ACMA を実行します。 高い塩 (KCl 200 mM) の相補的な荷電ベシクルの組み合わせ、非融合性小胞と+の PL なしだけで空マブラヴ-を使用しての手順 1-3 のように、制御の実験を実行します。注: は、相補的荷電ベシクルは図 6に示すように、使用された場合にのみ検出する postfusion LUV のプロトン ポンプ必要があります。 8. 電子輸送鎖膜のマブラヴと旦那、このチェーンによって ATP の生産で個々 のコンポーネントからのアセンブリ。 注: この手順の概略は、図 7Aの示されています。この実験で生成される ATP は、ルシフェラーゼによって合成された ATP のピロリン酸とアンプへの変換が続く、ルミノに登録されている発光ルシフェリン-ルシフェラーゼ システムによって登録されます。重要度の低いマイクロ プレート luminometers の代わりに単管ルミノを使用をお勧めします。 ボー3のミックス 3 μ L-オキシダーゼ PL+と+ F1Fo PL の 5 μ L 形成セクション 4 で説明されているようです。 バッファー 20 mM KCl と 5 分の 1 ミリメートル MgCl2と補われる D の 800 μ L のヒューズにマブラヴの GUV- 3 μ L (セクション 2 の説明に従って形成される)。 高濃度株式を使って postfusion 膜への 100 mM と 50 mM の最終濃度に KCl とモップを追加します。注: 後融合マブラヴの場合この手順が腫れを防ぐため、外部 (バッファー A) 間の浸透圧のオフセットが原因と小 (バッファー D) 塩の濃度。 必要に応じて、前述の未反応 SUV+を分離する 7.2 postfusion 膜をペレットし、バッファー a. の 800 μ L でペレットを再懸濁します ルシフェリン-ルシフェラーゼ-ADP のカクテル含む 400 μ M ADP、50 μ M ルシフェリン、バッファー A の 2.5 μ g ルシフェラーゼの 200 μ L を準備します。 カクテルを Step8.3 から postfusion の混合物に追加します。 40 μ M の酸化コエンザイム Q1を加えて、ボー3による postfusion 膜の通電をトリガー-2 mM DTT を追加することによって酸化酵素。1 分待ちます。 通電小胞に 5 mM リン酸カリウム (KP は私、pH 7.4) を追加することで ATP 合成を開始し、ルミノ (図 7 b) と ATP の生産を検出します。〜 3 分間反応を実行します。注: ATP 合成反応は、ボー3によって消費される酸素の枯渇まで 5-7 分の収入-オキシダーゼとルシフェラーゼ。 反応混合物に ATP 基準 (0.5 nmol ATP) を 2 回追加します。メジャー ATP が生成されます。 実際 ATP 参照標準信号による ATP 合成反応から信号を割って反応で生じた ATP の量を取得します。F1Fo反作用で使用されるの合計金額にこの値を調整し、最後に µmol ATP で ATP 合成の反応速度を表現/(mg F1Fo* 分)。