Privo di detersivo ultraveloce ricostituzione delle proteine di membrana in lipidici utilizzando fusogena proteoliposomi complementari a carico.

1. preparazione del fusogena LUV e SUV Preparazione della miscela del lipido fusogena Preparare soluzioni di riserva di lipidi neutri, cationici, anionici e fluorescenti in cloroformio a 25-50 mg/mL (ad esempio, neutro DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), cationici etilico-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glicero-3-ethylphosphocholine), POPA anionico (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) e fluorescente del colesterile-Bodipy-FL12, rispettivamente) pesando adeguate quantità di lipidi asciutti e loro dissoluzione in 100% cloroformio (attenzione! Farlo sotto cappa aspirante), o diluendo gli stock di cloroformio commercialmente disponibili dei lipidi con cloroformio.Nota: Sia lipidiche naturali estratti e lipidi sintetici puri possono essere utilizzati e dimostrano risultati simili. Una cationica di mix 2.5 mg e 2,5 mg di un lipide neutro in magazzino di cloroformio (1.1.1) in un flaconcino di vetro.Nota: Questo passaggio produce 5 mg di miscela di lipidi cationici in cloroformio, contenente la frazione di peso del 50% di lipidi cationici. Quando necessario, è possibile aggiungere 0,5% frazione di peso di un lipide fluorescente per la miscela. Mescolare 1 mg di anionici e 4 mg di lipidi neutri (1.1.1) delle scorte di cloroformio in un flaconcino di vetro. Questo dà 5 mg di miscela di tensioattivi anionici del lipido contenente 20% peso frazione dei lipidi anionici. Evaporare il cloroformio sotto un flusso di azoto per formare un sottile strato di lipidi asciutto. Rimuovere il cloroformio residuo sotto vuoto per 10 min.Nota: Tradizionalmente questo passaggio richiede molto più tempo (1-12 h), ma abbiamo trovato che un trattamento più lungo non fornisce nessun miglioramento evidente in proprietà di SUV di accoppiamento. Idratare il film lipidico asciutto aggiungendo 0,5 mL di tampone A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, MOPS di 50 mM, pH 7.4) per ogni flaconcino e lasciandoli riposare a temperatura ambiente per 30 minuti e poi vortice fino il film lipidico è completamente staccato dalla superficie del vetro e b riconoscibilissimo una sospensione omogenea del lipido. Questo dovrebbe prendere circa 20-40 s. Formazione di SUV e LUV di estrusione Assemblare un sistema di estrusione (Vedi la Tabella materiali) con due siringhe da 1 mL, utilizzando un filtro in policarbonato con uno dei seguenti formati del poro: 100 o 200 nm a forma SUV e 400 o 800 nm per formare LUV. Trasferire la sospensione del lipido in una siringa. Estrudere la sospensione facendolo passare attraverso il filtro 21 volte, come illustrato altrove18,19.Nota: Un numero dispari di passaggi è necessario per ridurre al minimo il trasferimento nella soluzione delle vescicole di lipidi grandi ciuffi attaccato al lato filtro rivolto verso la sospensione del lipido originale. Trasferire la soluzione di vescicola in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. 2. formazione di fusogena GUV dal metodo emulsione invertito Nota: Questa procedura è illustrata nella Figura 2. Preparazione della soluzione lipidica-in-olio Mescolare un brodo di cloroformio (Vedi punto 1.1.1) di un lipide neutro (2 mg) e un lipido anionico (0,5 mg) con 1 mL di esadecano in provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Evaporare il cloroformio dalla miscela sotto costante miscelazione e riscaldamento a 80 ° C per 30 min mantenendo aperto il tubo. Tappare la provetta e lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Formazione di un monostrato lipidico all’interfaccia del lipido-in-olio/tampone acquoso Posto 200 µ l della soluzione lipidica in olio sulla cima di 0,5 mL di tampone B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, MOPS 10 mM a pH 7.4) in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Si noti la forma convessa del confine di separazione di fase a causa di mancata corrispondenza di tensione superficiale tra l’olio e il tampone acquoso (Figura 2A). Attendere fino a quando il bordo di separazione di fase si appiattisce, che è indicativo di formazione dello strato monomolecolare del lipido su di esso. Questo richiede in genere 30-60 min a temperatura ambiente. Preparazione di un’emulsione acqua in olio Preparare una soluzione di un polisaccaride solubile in acqua e non ionici nel buffer B, con una densità maggiore di densità dell’acqua (ad es. 15% Ficoll-400 (w/v), con densità 1,05 g/mL)Nota: Facoltativamente, si possono aggiungere coloranti fluorescenti solubili in acqua per il buffer per una migliore visualizzazione di GUV e qualsiasi altro contenuto acquoso desiderato del Guv. Trasferire 0,5 µ l di miscela di cui sopra a una separata 1,5 mL centrifuga con 100 µ l della soluzione lipidica in olio da 2.1.2. Sottoporre ad ultrasuoni (44kHz alle 14 W) la miscela per 30 s in un bagno d’acqua ad ultrasuoni. Quindi, vigorosamente vortice per 45 min a formare un’emulsione acqua in olio, dove ogni goccia sarà rivestita da un monostrato lipidico (Figura 2B). Conversione dell’emulsione acqua in olio in GUV Posizionare l’emulsione risultante in cima l’interfaccia del lipido-in-olio/acquoso e centrifugare immediatamente la provetta in una centrifuga di tavolo a 10.000 x g per 2 min. Il pellet risultante di GUV dovrebbe essere chiaramente visibile (Figura 2). Raffreddare il tubo a 4 ° C in frigorifero a solidificare la miscela di lipidi in olio (Figura 2D, esadecano solidifica sotto i 18 ° C), rimuovere con cura l’olio congelato e poi ritirare la fase acquosa.Nota: Per facilitare l’olio è stato usato rimozione congelare un filo piegato a forma di un ancoraggio. Risospendere il pellet GUV in 50 µ l di tampone fresco B, trasferimento in una nuova provetta ed esaminare sotto un microscopio di fluorescenza usando un obiettivo a immersione in olio (Figura 2E) X 100. 3. monitoraggio fusione della vescicola con cobalto-calceina metodo Preparazione di una colonna di gravità di gel-filtrazione. Ammollo ~ 10 g di una resina di gel-filtrazione (ad es. superfine sephadex G-50) in 100 mL di acqua deionizzata e lasciare che si gonfiano durante la notte. Confezione da 3 mL della resina in una colonna di flusso di gravità di plastica usa e getta, lavarlo con acqua ultrapura ed equilibrare con buffer C (100 mM KCl, MOPS di 10 mM, pH 7,4) a temperatura ambiente. Preparazione di SUV+ o SUV0 caricato con cobalto-calceina. Preparare una soluzione contenente calceina 1 mM, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM MOPS, quindi portare il pH a 7.4.Nota: L’essenza del metodo è che quella gratuita calceina fluorescente forma un complesso non fluorescenti con Co2 +. Diventa fluorescente nuovamente con l’aggiunta di EDTA, che avendo maggiore affinità per Co2 +, sposta calceina dal complesso cobalto-calceina (Figura 3A). Aggiungere 500 µ l di questa soluzione per un film secco di lipidi cationici o neutri preparato come descritto in 1.1. Preparare 100 nm SUV di estrusione come descritto in 1.2. A pellet estruso SUV a 1.000.000 x g per 20 min in un tavolo ultracentrifuga e risospendere in 1 mL di tampone C. Ripetere cubettatura e risospensione tre volte; utilizzare 0,6 mL di tampone C per la risospensione di ultimo.Nota: Questa procedura rimuovere la maggior parte della calceina-cobalto esterno. Rimuovere i resto esterno cobalto-calceina passando SUV attraverso una colonna di gravitá monouso caricata con la resina di gel-filtrazione equilibrata con buffer C come descritto al punto 3.1.2.Nota: In genere scartare il primo volume di millilitro del flusso continuo e raccogliere la seconda millilitro, che contiene cobalto-calceina esterno gratuito SUV. Preparazione di SUV– caricato con EDTA Preparare la soluzione di 10 mM EDTA, 80 mM NaCl, MOPS di 10 mM, pH 7.4. Aggiungere 500 µ l di questa soluzione per un film secco di lipidi anionici preparata come descritto in 1.1. Preparare SUV– di estrusione come descritto in 1.2. Pellet e risospendere SUV– , come descritto in 3.2.4. Rimuovere l’EDTA rimanente passando SUV– attraverso la colonna di gel-filtrazione, come descritto in 3.2.5. Preparazione di SUV per fusione Diluire il SUV0,+di SUV e SUV– con tampone D (MOPS di 1 mM, pH 7.4) completati con 0,2 mM CoCl2 e la concentrazione di KCl. uso 5 µ l di ciascun tipo di SUV per 1 mL di tampone D. Incubare la miscela per almeno 1 h.Nota: Questo passaggio riduce al minimo il livello di fluorescenza di fondo bloccando calceina che è associata a superficie ai SUV+. Fusione della vescicola Avviare la reazione di fusione mescolando 1 mL di SUV+ o SUV0 con 1 mL di SUV− (diluito in tampone D come descritto sopra) in una provetta 2 mL fluorimetro e monitor aumento di fluorescenza di calceina utilizzando 480 nm eccitazione e 510 nm emissione (Figura 3B). Attendere fino a quando la reazione viene a compimento. Aggiungere una miscela di detergente Triton X-100 ed EDTA (concentrazione finale di 0.05% e 7 mM, rispettivamente) per rilasciare calceina fuori vescicole e ottenere il segnale di fluorescenza massima. Determinare la portata della fusione definito come la percentuale del segnale massimo fluorescenza dopo l’aggiunta di detersivo come mostrato in Figura 3. 4. veloce ricostituzione delle proteine di membrana nei proteoliposomi fusogena Nota: Questa procedura è illustrata in Figura 4A. Preparare una colonna di flusso di gravità con la resina di gel-filtrazione, come descritto in 3.1 ed esso equilibrare con tampone A temperatura ambiente.Nota: Tutte le manipolazioni ulteriore devono essere fatto rigorosamente a ≤ 4 ° C, a meno che non diversamente indicato, per minimizzare la perdita di attività della proteina. Regolare la concentrazione della proteina purificata membrana a 0,7 mg/mL diluendo con il tampone di estrazione stesso utilizzato per l’isolamento di proteine. µ L di mix 140 della proteina con 300 µ l di SUV preformato, 160 µ l tampone A e 60 µ l di 10% colato in Buffer A; Questo dà 01:30 proteine: rapporto peso del lipido in un volume finale di 660 µ l. Agitare delicatamente il composto su una piattaforma a dondolo per 15 min.Nota: La seguente procedura può essere eseguita a temperatura ambiente. Passare il composto attraverso resina di gel-filtrazione e raccogliere torbide frazioni contenenti proteoliposomi. A pellet proteoliposomi con un tavolo ultracentrifuga a 400.000 x g per 15 min. Eliminare il supernatante contenente proteine non ricostituito e risospendere il pellet in 1 mL di tampone fresco A. Determinare il contenuto di proteina in PL e il supernatante utilizzando il metodo di Amido-Nero20. Determinare il rendimento di ricostituzione, che in genere è di circa 50-70%.Nota: Passaggi 4.6-4.8 facoltativamente possono essere sostituiti mediante il passaggio di soluzione PL attraverso 1 mL di resina Ni-NTA imballato in una colonna di gravità monouso e lavato con tampone A come descritto in 3.1.2. Tale passaggio si separerà non ricostituito proteina, che sarà preferenzialmente associata alla resina, da PL, più sarà nel flusso continuo. 5. test funzionali dell’attività della proteina nei proteoliposomi Nota: Entrambe le proteine utilizzate in questo studio sono pompe del protone potente, che pompa H+ in proteoliposomi con l’aggiunta di loro substrati (coenzima Q1 per bo3-ossidasi e ATP per F1Fo, rispettivamente), così edificio una pendenza del protone attraverso la membrana (ΔpH). In caso di successo co-ricostituzione di fusione, tale acidificazione può essere osservato come una diminuzione in fluorescenza di una sonda di pH sensibili ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, che è usato ordinariamente per tali attività ( Figura 4B -C). Inoltre substrato-specifica attività delle proteine (coenzima Q1 ossidazione di bo3-ossidasi22 e idrolisi dell’ATP da F1Fo23,24) può essere monitorata spettrofotometricamente usando vari metodi. Qui, noi dimostrare attività di idrolisi di ATP di F1Fo PL utilizzando un ATP rigenerante test (Figura 4), dove due enzimi (piruvato chinasi (PK) e lattato deidrogenasi (LDH) mantenere una costante concentrazione di ATP come segue. PK ricicla ATP convertendo ADP prodotto da F1Fo indietro nell’ATP a scapito del suo substrato fosfoenolpiruvato (PEP). Piruvato, che è un prodotto di questa reazione, viene convertito in lattato di LDH a scapito di NADH, l’ossidazione di cui può essere monitorato come diminuire la densità ottica a 340 nm. Preparazione di prodotti chimici Preparare 1 mM brodo di ACMA in etanolo. Preparare uno stock di 1 mM di Nigericina (o qualsiasi altro disaccoppiatore) in etanolo. Preparare stock di 25 mM coenzima Q1 in etanolo e 1 M tra gli stock DTT nel buffer A. Preparare un brodo di 100mm ATP in tampone A e regolare il pH a 7.4. Preparare scorte di ATP rigenerando i componenti del sistema a tampone a: 100 mM PEP, 1mm NADH e soluzioni di PK e LDH a concentrazione di ~ 500-1.000 unità/mL. Coenzima Q1 ossidazione-driven protone pompaggio dal bo3-ossidasi PL Aggiungere 20 µ l di PL per una cuvetta fluorimetro con tampone 2 mL A in presenza di 0,5 µM ACMA e attendere il segnale stabile utilizzando 430 nm eccitazione e 515 nm emissione. Aggiungere 40 µM coenzima Q1 la cuvetta. Avviare protone pompaggio aggiungendo 2 mM DTT al PL (Figura 4B).Nota: DTT riduce ossidata di coenzima Q1 e lo rende disponibile a bo3-ossidasi. Dissipare ΔpH formate aggiungendo disaccoppiatore di 2 µM (ad esempio Nigericina). Segnale di fluorescenza di ACMA dovrebbe tornare rapidamente a quasi il livello originale.Nota: non ci dovrebbe essere nessun ACMA tempra con l’aggiunta del substrato, se il corredo è inizialmente presente nella miscela di reazione. Protone basati su idrolisi di ATP di pompaggio di F1FoPL Aggiungere 40 µ l di PL in una cuvetta fluorimetro come descritto al punto 5.2. Avviare protone pompaggio aggiungendo 0,2 mM ATP al PL (Figura 4). Dissipare il ΔpH come descritto in 5.2.4. Idrolisi dell’ATP da F1FoPL e la sua stimolazione dal disaccoppiatore Aggiungere 40 µ l di PL in una cuvetta spettrofotometro con 2 mL tampone A, contenente ATP di 1 mM, 0,2 mM NADH, 2mm PEP e 15 µ l di PK e LDH. Seguire la reazione misurando la diminuzione di assorbanza del NADH a 340 nm. 3-4 min aggiungere successivamente, disaccoppiatore µM 2 la cuvetta per rilasciare la contropressione del ΔpH su idrolisi dell’ATP. La velocità di reazione dovrebbe aumentare immediatamente.Nota: PL attraversato resina Ni-NTA come descritto nella 4.10 dimostrerà la stimolazione più forte del disaccoppiatore (traccia diFigura 4, rosso), mentre l’eluato sarà a malapena stimolata (traccia blu). 6. test influenza dell’ambiente del lipido e della forza ionica sulla funzionalità delle proteine di membrana nei proteoliposomi fusogena Valutare il protone pompaggio da 40 µ l di PL+, PL– e PL0 con il saggio dissetante ACMA in 2 mL Tampone D completati con 1 mM MgCl2 e 20 (Figura 5, pannello A) o 100 mM KCl (pannello B) come descritto in 5.2 o 5.3 (Figura 5 tracce di rosse, nere e blue). Fusibile 40 µ l di PL+ con lo stesso volume di LUV– in 2 mL di tampone D completati con 20 mM KCl e prova per tempra (traccia verde) ACMA. Eseguire esperimenti di controllo come in passaggio 2 di miscelazione, ad esempio, PL e SUV della stessa carica (grigio traccia).Nota: Protone pompaggio dovrebbe essere migliorato mediante postfusion pl 7. consegna delle proteine di membrana in LUV e GUV da fusogena proteoliposomi Fusibile 50 µ l di PL+ con 50 µ l di 800 nm LUV– in 1 mL di tampone D completati con 1 mM MgCl2e 20 mM KCl per 5 min. A pellet le vescicole a 6.000 x g per 5 min e scartare il supernatante contenente non reagito PL+. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone D completati con 1 mM MgCl2 e 100 mM KCl e ripetere la cubettatura e risospendere due volte più. Eseguire ACMA tempra dosaggio come descritto in 5.2 o 5.4. Eseguire esperimenti di controllo, come nei passaggi 1-3, utilizzando combinazioni di vescicole complementari caricate in alto sale (200 mM KCl), non-fusogena vescicole e solo vuote LUV– senza PL+.Nota: Protone di pompaggio di postfusion LUV deve essere rilevato solo quando modo complementare caricate vescicole sono state utilizzate come mostrato nella Figura 6. 8. montaggio della catena di trasporto degli elettroni da singoli componenti in membrane di LUV GUV e produzione di ATP da questa catena. Nota: Lo schema di questa procedura è illustrato nella figura 7A. ATP prodotto in questo esperimento verrà registrato dal sistema luciferina-luciferasi, dove la conversione di ATP sintetizzato in AMP e pirofosfato di luciferasi è seguito da emissione di luce registrata con un luminometro. È consigliabile utilizzare un luminometro tubo singolo, anziché il meno sensibile luminometri micropiastra. Mix 3 µ l di bo3-ossidasi PL+ e 5 µ l di F1Fo PL+ formata come descritto nella sezione 4. Li con 3 µ l di LUV o GUV– (formata come descritto nella sezione 2) fusibile in 800 µ l di tampone D completati con 20 mM KCl e 1 mM MgCl2 per 5 min. Utilizzano supporti di alta concentrazione, aggiungere KCl e MOPS alla concentrazione finale di 100 mM e 50 mM per le membrane postfusion.Nota: In caso di post-fusione LUV, questo passaggio impedirà loro gonfiore a causa di offset osmotico tra esterno (tampone A) e concentrazione di sali di intravesicular (buffer D). Facoltativamente, le membrane postfusion il pellet come descritto al punto 7.2 per separare non reagito SUV+e risospendere il pellet in 800 µ l di tampone A. Preparare 200 µ l di un luciferina-luciferasi-ADP cocktail contenenti 400 µM ADP, luciferina di 50 µM e 2,5 µ g luciferasi in tampone A Aggiungere il cocktail per la miscela di postfusion da Step8.3. Aggiungere 40 µM di ossidato coenzima Q1e innescare energizzazione delle membrane postfusion da bo3-ossidasi aggiungendo 2 mM DTT. Attendere per 1 min. Avviare la sintesi di ATP con l’aggiunta di fosfato di potassio 5 mM (KPho, pH 7.4) alle vescicole eccitate e rilevare la produzione di ATP con un luminometro (figura 7B). Eseguire la reazione per ~ 3 min.Nota: La reazione di sintesi di ATP procede per 5-7 minuti fino ad esaurimento dell’ossigeno consumato dal bo3-ossidasi e luciferasi. Aggiungere due volte la miscela di reazione standard di riferimento di ATP (0,5 nmol ATP). Misura ATP prodotta. Ottenere la quantità effettiva di ATP prodotto nella reazione dividendo il segnale dalla reazione di sintesi di ATP ATP segnale di riferimento standard. Modificare questo valore per la quantità totale di F1Fo utilizzati nella reazione e infine esprimere il tasso di sintesi di ATP in µmol ATP / (mg F1Fo* min).