JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

Published: April 05, 2018
doi:
10.3791/56909
, , , ,
1First Pavlov State Medical University, 2Clarendon Laboratory, Department of Physics,Oxford University, 3Department of Biological Sciences,Southern Methodist University

Summary

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים מרביים הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes, פיוז’ן של proteoliposomes כזה עם היעד bilayers השומנים למסירה ללא אבקת החלבונים האלה ממברנה לתוך bilayer postfusion. השילוב של גישות אלה מאפשר הרכבה מהירה וקלה לשליטה של מערכות ממברנה רב רכיבים מורכבים.

Abstract

דטרגנטים הן תנאי הכרחי עבור משלוח של קרום חלבונים לתוך שלפוחית קטנה unilamellar 30-100 ננומטר, בעוד bilayers השומנים מודל מורכב יותר, גדול יותר תואמים פחות חומרי ניקוי.

כאן נתאר אסטרטגיה לעקוף מגבלה זו יסוד באמצעות fusogenic הפוך טעונה ליפוזומים הנושאת חלבון ממברנה עניין. המיזוג בין שלפוחית כזה מתרחש בתוך 5 דקות במאגר עוצמת יוניים נמוכה. ליפוזומים fusogenic הטעון חיובית יכול לשמש כמו הסעות פשוטה וקטורים למסירה ללא חומרי ניקוי של קרום חלבונים לתוך ביונים היעד השומנים bilayers, אשר מחויב באופן שלילי. אנו גם מראים כיצד לשקם קרום חלבונים לתוך fusogenic proteoliposomes עם פרוטוקול במהירות 30-מין.

שילוב שתי הגישות האלה, נדגים אסיפה מהיר בשרשרת האלקטרונים תחבורה בהיקף של שני חלבונים ממברנה מ- e. coli, משאבת פרוטון העיקרי בו3-אוקסידאז ו- F1Fo ATP סינתאז, ב הממברנות של שלפוחית בגדלים שונים, החל 0.1 > 10 מיקרון, כמו גם ייצור ATP על ידי שרשרת זו.

Introduction

Functionalization של bilayers שומנים בדם מלאכותי עם קרום חלבונים היא צעד המפתח בהרכבה של קרום דגם מערכות. הדגם הפשוט ביותר, proteoliposomes (PL), מורכבת קטנים (30-200 ננומטר קוטר) unilamellar שלפוחית (רכב שטח, גם בשם ליפוזומים), עם חלבונים משולבים הקרומים שלהם. PL נוצרות באופן מסורתי בשני שלבים1. רכב שטח ראשון, preformed מעורבבים עם חלבון ממברנה של עניין חומר ניקוי-ריכוז מעל שלה ריכוז קריטי מיצלה (CMC). שנית, הנוזל מוסר עם דיאליזה, “ביו-חרוזים” או ג’ל סינון בטכניקות שונות, עוזב את החלבון ממברנה. הגישה השנייה היא הרבה יותר מהר (~ 30 דקות1), ולכן עדיף שיחזור של חלבוני ממברנה שברירי ורגיש, בעוד קודם שתי הגישות מוגבלים על ידי הסרת דטרגנט מהירות, אשר לוקח שעות רבות, עלולה לגרום אובדן משמעותי של הפעילות ואובדן השלמות המבנית של החלבונים. Functionalization של גדול שלפוחית (unilamellar גדול שלפוחית, אהובי, עד קוטר 1 מיקרומטר) לפי גישה זו הוא יותר מאתגרת, כמו שלפוחית בגודל מקבל מופחת לאחר הסרת דטרגנט, זה בלתי אפשרי עבור שלפוחית unilamellar ענק (בוס, > 1 מיקרומטר), כפי שהם גרם אולי לפגיעה ביציבות על ידי חומרי ניקוי (אך ראה ג’ונסון. et al. 2 עבור דו-ממדי-התגבשות איטית של חלבוני ממברנה ב bilayers גדול). גישות חלופיות עבור בוס ממברנה functionalization3,4,5 קיים אבל הם מפרך, זמן רב, עדיין דורשים נוזל כביסה בריכוזים מתחת CMC. יותר מורכבים או שביר השומנים מודלים (לדוגמה, Bilayers הידרוג Droplet6 ו- 3D להדפסה מבוסס-Droplet ממשק Bilayer מלאכותי רקמות7) לא יכול לסבול דטרגנטים. מתעוררים במהירות יישומים בביולוגיה סינתטית8,9,10 אנושות תלויים functionalization של מבנים מורכבים קרום כזה. לכן, שיטת קל וחזק המאפשר משלוח מהיר, עדין של קרום חלבונים לתוך bilayers שברירי היעד הוא ביקש מאוד בשטח.

חלופה, שיטת מסירה ללא אבקת חלבון היא היתוך שלפוחית, איפה יתאחדו הממברנות של שלפוחית שמעצבת bilayer postfusion, ללא פגע בעוד התוכן מימית intravesicular שלהם נקשרות, מבלי ששוחרר לתוך החיצוני סביבה. שלפוחית פיוז’ן מופעלת והוא מונע על-ידי rearrangements הסתגלותי בתוך סוכנים fusogenic משלימים (כמה חלבונים11,12 ופפטידים13 או דנ א שונה במיוחד14) ממוקם על פנייה bilayers, או Coulombic אינטראקציות בין השומנים bilayers יצרו של ליפידים cationic ו anionic טעון complementarily15,16, או cationic bilayers חלבונים טעונים שלילית17.

הגישה לשעבר דורש הנוכחות של סוכנים fusogenic בקרום שמעצבת לפני היתוך, יחסית איטי (~ 30 דקות להגיע חצי-מקסימום של פיוז’ן12,18), אך ניתן להחיל על טבעית ומלאכותית ממברנות.

היתרון של הגישה באמצעות fusogenic שומנים (איור 1) הוא שהם מאפשרים הרבה יותר מהר ממברנה פיוז’ן (~ 1 דקות כדי להגיע מקסימום חצי, ו 5-10 דקות כדי לסיים את התגובה). בנוסף, מידת פיוז’ן יכול להיות נשלט על ידי i) קל לגבש תוכן יחסית של שומנים טעון ב- fusogenic bilayers, ו- ii) יוניים, הכוח כלליות, osmotic של המדיום התגובה (מלחים-מעל 50 מ מ, לדוגמה, סוכרוז15 מוצגים להפסיק fusion), או שילוב של שניהם. ליזום פיוז’ן, שלפוחית fusogenic הפוך טעונה מעורבבים במדיום כוח יונית נמוך (בדרך כלל 10-20 מ מ מלח) למשך 5-10 דקות. חיסרון יחסי של השיטה היא שומנים cationic לנצל השפעה שלילית על הפונקציונליות של חלבוני ממברנה ב proteoliposomes cationic לפני היתוך, במיוחד באזור נמוך כוח יונית, אבל האפקט הזה הוא הפיך על ידי טבעי הרכב השומנים של קרום פוסט-פיוז’ן והחזרה שלו למדיום כוח יונית נורמלי.

Protocol

1. הכנת fusogenic SUV, מתוקה הכנת תערובת השומנים fusogenic להכין מלאי פתרונות של ליפידים נייטרלי, cationic, anionic, פלורסנט ב כלורופורם ב 25-50 מ”ג/מ”ל (לדוגמה, נייטרלי DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), cationic אתיל-PC (1, 2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), anionic פופה (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate), ופלורסנט cholesteryl-Bodipy-FL12, בהתאמה) על ידי שקילה כמויות מתאימות של ליפידים יבש המסת אותם ב-100% כלורופורם (זהירות! לעשות זאת תחת ברדס fume), או דילול מניות כלורופורם זמינים מסחרית של ליפידים עם כלורופורם.הערה: תמציות השומנים הטבעיים וגם שומנים סינתטי טהור יכול לשמש ומדגימים תוצאות דומות. מיקס 2.5 מ”ג cationic ו- 2.5 מ”ג של ליפופרוטאין נייטרלי במלאי כלורופורם (1.1.1) בבקבוקון זכוכית.הערה: שלב זה מניב 5 מ”ג של השומנים cationic תערובת ב כלורופורם, המכיל 50% משקל חלק של ליפידים cationic. בעת הצורך, להוסיף התערובת 0.5% שבר משקל של ליפופרוטאין פלורסנט. מערבבים 1 מ ג של anionic ו- 4 מ”ג של ליפידים נייטרלי במניות כלורופורם (1.1.1) בבקבוקון זכוכית. זה נותן 5 מ”ג של השומנים anionic תערובת המכילה 20% משקל חלק של ליפידים anionic. להתנדף כלורופורם תחת זרם של חנקן כדי ליצור שכבה דקה של השומנים יבש. הסר את הכלורופורם שיורית תחת ואקום למשך 10 דקות.הערה: באופן מסורתי שלב זה לוקח הרבה יותר זמן (1-12 h), אבל מצאנו כי טיפול ארוך יותר מספק אין שיפור ברור צימוד המאפיינים של רכב שטח. מימה הסרט יבש השומנים על ידי הוספת 0.5 mL מאגר A (100 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2, 50 מ מ סחבות, pH 7.4) כל בקבוקון. ומשאירה אותם לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות ולאחר מכן מערבולת עד הסרט השומנים מנותקת לגמרי מן משטח זכוכית ו b ecomes השעיה השומנים הומוגנית. זה יארך כ 20-40 s. היווצרות של רכב שטח, אהובה על ידי ההבלטה להרכיב מערכת שחול (ראה את הטבלה של חומרים) עם שני מזרקים 1 מ”ל באמצעות אחת מהפעולות הבאות מסנן פוליקרבונט הנקבוביות בגדלים: 100 או 200 ננומטר לטופס רכב שטח, 400 או 800 nm לצורה אהובה. העברת השומנים ההשעיה לתוך מזרק. הבלטת התליה על ידי העברתו דרך המסנן פעמים 21, כפי שמוצג במקום18,19.הערה: מספר אי-זוגי של מעברים יש צורך למזער העברת לתוך הפתרון שלפוחית של גושים גדולים השומנים תקוע לצד סינון הפונים השומנים ההשעיה המקורית. העברת פתרון שלפוחית לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL. 2. היווצרות Fusogenic בוס בשיטה הפוכה אמולסיה הערה: הליך זה מודגם באיור2. הכנה של פתרון השומנים בתוך שמן לערבב מניה כלורופורם (ראה שלב 1.1.1) של ליפופרוטאין נייטרלי (2 מ ג), של anionic שומנים בדם (0.5 מ ג) עם 1 מ”ל של hexadecane בצינור microcentrifuge 1.5-mL. להתנדף כלורופורם מעירוב תחת ערבוב וחימום קבוע ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשמור על הצינור. לסגור את הצינור ומצננים לטמפרטורת החדר. היווצרות טפט השומנים-הממשק מאגר השומנים-בשמן/מימית במקום 200 µL של הפתרון השומנים בתוך שמן מעל 0.5 mL מאגר B (20 מ מ אשלגן כלורי, 0.1 מ מ MgCl2, 10 מ מ מגבים pH 7.4) בשפופרת צנטרפוגה 1.5 mL. שימו לב צורת קמורה לגבול ההפרדה שלב בגלל חוסר התאמה של מתח בין השמן לבין המאגר מימית (איור 2 א). המתן עד לגבול ההפרדה שלב משטחת, וזה מעיד על היווצרות ליפיד חד שכבתי עליו. זה בדרך כלל לוקח 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. הכנת אמולסיה מים בתוך שמן להכין פתרון של מסיסים במים ללא יונית רב-סוכר במאגר B, עם צפיפות גבוהה יותר צפיפות של מים (למשל 15% Ficoll-400 (w/v), עם צפיפות 1.05 g/mL)הערה: לחלופין, אחד יכול להוסיף צבעי פלורסנט מסיסים במים המאגר כדי שתראי טוב יותר של בוס, אחרים הרצוי מימית תוכן האנשים שנגדם. העבר µL 0.5 של תערובת לעיל כדי שפופרת צנטרפוגה 1.5-mL נפרד עם 100 µL של הפתרון השומנים בתוך שמן 2.1.2. Sonicate (44 kHz בגיל 14 W) את התערובת ל 30 s באמבט מים אולטרה סאונד. אז, נמרצות מערבולת למשך 45 דקות ליצור אמולסיה של מים בתוך שמן, איפה מצופה לכל droplet על ידי טפט שומנים בדם (איור 2B). המרה של האמולסיה מים בתוך שמן לתוך בוס למקם את תחליב תוצאות על גבי הממשק השומנים-בשמן/מימית, מיד centrifuge את הצינור ומפרידה שולחני ב 10,000 x g למשך 2 דקות. בגדר תוצאה של בוס צריך להיות בבירור (איור 2C). מגניב הצינור עד 4 ° C במקרר כדי לחזק את התערובת השומנים בתוך שמן (איור דו-ממדי, hexadecane מתמצק מתחת 18 ° C), הסר בזהירות שמן קפוא, ואז מסירים את פאזה מימית.הערה: כדי להקל על שמן הסרת ההקפאה חוט מכופף בצורת עוגן שימש. Resuspend בגדר בוס ב- 50 µL טריים מאגר B, העברת צינור טריים, ולבדוק במיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות 100 X שמן טבילה מטרה (2E איור). 3. פיקוח על שלפוחית פיוז’ן בשיטה קובלט-Calcein הכנת ג’ל-סינון הכבידה עמודה. להשרות ~ 10 גר’ ג’ל-סינון שרף (למשל superfine ספדקס G-50) 100 מיליליטר מים יונים, ולתת לתפוח במשך הלילה. חבילת 3 מ”ל של השרף לעמודה זרימת הכבידה פלסטיק חד פעמיות, לשטוף אותו עם מים הנדסה גנטית, equilibrate עם מאגר C (100 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ סחבות, pH 7.4) בטמפרטורת החדר. הכנת+ רכב שטח או רכב שטח0 עמוסה קובלט-calcein. להכין פתרון המכיל 1 מ calcein, 1 מ CoCl2, 98 מ מ NaCl, סחבות 10 מ מ, ואז להביא pH 7.4.הערה: מהות השיטה היא ש-calcein פלורסנט חינם זה יוצר מתחם הלא-פלורסנט עם Co2 +. הוא הופך להיות פלורסנט שוב על תוספת של EDTA, מהם בעל זיקה גבוהה יותר עבור Co2 +, מזיחה calcein מהמתחם קובלט-calcein (איור 3 א). להוסיף 500 µL של פתרון זה סרט יבש של ליפידים cationic או ניטראליים מוכן כמתואר ב- 1.1. להכין 100 ננומטר רכב שטח על ידי ההבלטה כמתואר ב- 1.2. גלולה מעוקם רכב שטח-1,000,000 g x עבור 20 דקות ב- ultracentrifuge שולחני, resuspend ב 1 מ”ל של מאגר C. חזור על pelleting ו- resuspension שלוש פעמים; השתמש 0.6 מ”ל של מאגר C resuspension האחרון.הערה: השלבים להסיר את מרבית קובלט-calcein חיצוניים. הסר את הנותרים חיצוני קובלט-calcein על-ידי העברת רכב שטח דרך העמודה זרימת הכבידה חד פעמיות נטען עם שרף ג’ל-סינון equilibrated עם מאגר C כפי שמתואר בשלב 3.1.2.הערה: אנחנו בדרך כלל לבטל את נפח מיליליטר הראשון של הזרימה דרך ולאסוף את מיליליטר השני, אשר מכיל קובלט חיצוני-calcein חינם רכב שטח. הכנת רכב שטח– טעון עם EDTA הכן תמיסה של 10 מ מ EDTA, 80 מ מ NaCl, 10 מ מ סחבות, pH 7.4. להוסיף 500 µL של פתרון זה סרט יבש של שומנים anionic מוכן כמתואר ב- 1.1. הכן SUV– על ידי ההבלטה כמתואר ב- 1.2. גלולה, resuspend SUV– , כפי שמתואר 3.2.4. הסר את EDTA שנותרו על ידי עובר רכב שטח– ג’ל-סינון העמודה כפי שמתואר 3.2.5. הכנת רכב שטח פיוז’ן לדלל SUV0, הג’יפ+, רכב שטח– עם מאגר D (1 מ מ מגבים, pH 7.4) בתוספת 0.2 מ מ CoCl2 , הריכוז הרצויה של אשלגן כלורי. שימוש 5 µL של כל סוג של רכב שטח לכל 1 מ”ל של מאגר ד דגירה את התערובת במשך לפחות שעה.הערה: שלב זה יצמצם את רמת קרינה פלואורסצנטית רקע על ידי חסימת calcein זה משטח מאוגד ל SUV+. שלפוחית פיוז’ן להתחיל תגובתיות על ידי ערבוב 1 מ”ל של+ רכב שטח או רכב שטח0 עם 1 מ”ל של רכב שטח− (מדולל במאגר D כמתואר לעיל) cuvette fluorimeter 2-mL, ו צג הגדלת זריחה של calcein באמצעות עירור 480 ננומטר ו- 510 ננומטר פליטה (איור 3B). המתן עד התגובה מגיע לסיום. להוסיף תערובת של טריטון X-100 דטרגנט EDTA (הריכוז הסופי של 0.05% ו- 7 מ מ, בהתאמה) לשחרר את calcein מחוץ שלפוחית ולקבל את האות המרבי זריחה. לקבוע את היקף פיוז’ן המוגדר כאחוז של האות המרבי פלורסצנטיות בעקבות תוספת דטרגנט, כפי שמוצג באיור 3C. 4. מהר הכינון של קרום חלבונים לתוך Fusogenic Proteoliposomes הערה: הליך זה מודגם ב איור 4A. להכין עמודה זרימת הכבידה עם שרף ג’ל-סינון כמתואר ב- 3.1, equilibrate זה עם מאגר A בטמפרטורת החדר.הערה: כל המניפולציות נוספת חייב להיעשות אך ורק ב ≤ 4 ° C, אלא אם צוין אחרת, כדי למזער את אובדן פעילות החלבון. להתאים ריכוז החלבון ממברנה מטוהרים ל 0.7 מ”ג/מ”ל לדלל אותה עם המאגר החילוץ באותו המשמש לבידוד חלבון. µL 140 מיקס של החלבון עם 300 µL של רכב שטח preformed, 160 א מאגר µL 60 µL של 10% cholate במאגר A; זה נותן 1:30 חלבון: יחס משקל השומנים באמצעי אחסון 660 µL הסופי. לנער בעדינות את התערובת על משטח נדנדה למשך 15 דקות.הערה: השלבים הבאים יכול להתבצע בטמפרטורת החדר. עוברים את התערובת דרך ג’ל-סינון שרף, לאסוף את השברים עכורים המכיל proteoliposomes. גלולה proteoliposomes עם ultracentrifuge שולחני ב 400,000 x g למשך 15 דקות. למחוק את תגובת שיקוע המכיל חלבון שאינו מחדש, resuspend בגדר ב 1 מ”ל טריים מאגר א לקבוע את תכולת חלבון PL, את תגובת שיקוע באמצעות שיטת Amido-שחור20. לקבוע את התשואה של שיחזור, אשר בדרך כלל הוא בסביבות 50-70%.הערה: השלבים 4.6-4.8 ייתכן לחלופין יוחלף עובר PL פתרון באמצעות 1 מ”ל של שרף Ni-נ הארוזים לתוך עמודה כוח משיכה חד פעמית ושטף עם מאגר A כמתואר 3.1.2. כזה שעובר בין חלבון שאינו מחדש, אשר מעדיפים יאוגד שרף, מ- PL, ביותר אשר יהיה הזרימה דרך. 5. פונקציונלי בדיקות של פעילות החלבון ב- Proteoliposomes הערה: שני חלבונים השתמשו במחקר זה הם משאבות פרוטונים רב עוצמה, אשר משאבה H+ לתוך proteoliposomes על תוספת של סובסטרטים שלהם (קואנזים Q1 בו3-אוקסידאז, ATP עבור F1Fo, בהתאמה), ובכך בניין מעבר פרוטון צבע על פני הקרום (ΔpH). במקרה של שיחזור לעבודה מוצלחת על ידי היתוך, acidification כזה יכול להיות שנצפו כמו ירידה זריחה של בדיקה pH רגיש ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, אשר משמש באופן שגרתי כזה (משימות איור 4B -C). בנוסף המצע ספציפיים פעילות של החלבונים (חמצון1 קואנזים Q ב- bo3-אוקסידאז22 ו- ATP הידרוליזה על ידי F1Fo23,24) ניתן לנטר spectrophotometrically באמצעות שיטות שונות. . הנה, נדגים פעילות הידרוליזה של ATP של F1Fo PL באמצעות של ATP נוצר assay (איור 4D), בו שני אנזימים (פירובט קינאז (PK) ו לקטט דהידרוגנאז (LDH) לשמור על ריכוז קבוע של ATP כדלקמן. PK ממחזרת ATP על-ידי המרת ADP המיוצר על ידי1F Fo בחזרה לתוך ATP על חשבון phosphoenolpyruvate המצע שלה (PEP). פירובט, שהוא תוצר של תגובה זו, מומר לקטט מאת LDH על חשבון NADH, החמצון של אשר ניתן לנטר כמו הפחתת צפיפות אופטית-340 ננומטר. הכנה של כימיקלים להכין 1 מ”מ ACMA מניות של אתנול. להכין מלאי 1 מ”מ של nigericin (או כל uncoupler אחרים) אתנול. להכין 25 מ מ קואנזים Q1 המניות אתנול, 1 מ’ מניות DTT במאגר א להכין מלאי של 100 מ מ ATP במאגר A, והתאם את החומציות כדי 7.4. להכין מלאי של ATP נוצר מחדש רכיבי מערכת מאגר ת 100 מ מ העידוד, 1 מ מ NADH ו פתרונות של PK, LDH-ריכוז של ~ 500-1, 000 יחידות/mL. 1 מונע חמצון קואנזים Q פרוטון שאיבה ב- bo3-אוקסידאז PL להוסיף 20 µL של PL cuvette fluorimeter עם מאגר 2 מ ל א בנוכחות של 0.5 מיקרומטר ACMA והמתן עד האות יציב באמצעות עירור 430 nm ו- 515 פליטה ננומטר. להוסיף 40 µM קואנזים Q1 cuvette. ליזום פרוטון שאיבה על-ידי הוספת 2 מ מ DTT PL (איור 4B).הערה: DTT מפחית קואנזים Q מחמצנים1 ואת עושה את זה לרשות בו3-אוקסידאז. להפיג ΔpH בנוי על-ידי הוספת 2 מיקרומטר uncoupler (לדוגמה nigericin). ACMA קרינה פלואורסצנטית אות צריכים להחזיר במהירות כמעט לרמה המקורית.הערה: צריך להיות לא ACMA שהקשה על תוספת של המצע, אם uncoupler נמצא תערובת התגובה בתחילה. ATP מונחה הידרוליזה פרוטון שאיבה מאת F1FoPL להוסיף 40 µL של PL cuvette fluorimeter כמתואר ב- 5.2. ליזום פרוטון שאיבה על-ידי הוספת 0.2 מ מ ATP PL (איור 4C). להפיג ΔpH כפי שמתואר 5.2.4. הידרוליזה של ATP על ידי F1FoPL, גירוי שלה על ידי uncoupler הוסף µL 40 של PL ל cuvette ספקטרופוטומטרים עם 2 מ”ל מאגר A, המכיל 1 מ מ ATP, 0.2 מ מ NADH, 2 מ מ. העידוד, 15 µL כל של PK ו- LDH. בצע את התגובה על ידי מדידת ספיגת ירידה של NADH-340 ננומטר. 3-4 דקות מאוחר יותר, להוסיף 2 מיקרומטר uncoupler cuvette כדי לשחרר את backpressure של ΔpH על הידרוליזה של ATP. מהירות התגובה צריך להגדיל באופן מיידי.הערה: PL עברו שרף Ni-נ כמתואר ב- 4.10 תדגים הגירוי החזק ביותר על ידי uncoupler (איור 4D, אדום trace), בעוד eluate יהיה מגורה בקושי (trace כחול). 6. בוחן את השפעת הסביבה השומנים וכוח יוניים על הפונקציונליות של חלבוני ממברנה ב- Fusogenic Proteoliposomes להעריך פרוטון שאיבה מאת 40 µL של PL+,– PL PL0 עם ACMA assay שכבתה ב 2 mL מאגר D בתוספת 1 מ”מ MgCl2 ו- 20 (איור 5, פאנל A) או 100 מ מ אשלגן כלורי (לוח ב’) כפי שמתואר 5.2 או 5.3 (איור 5 עקבות אדום, שחור וכחול). נתיך µL 40 של PL+ באותו אמצעי אחסון של סיגל גבעון– , ב- 2 מ של מאגר D בתוספת 20 מ מ אשלגן כלורי, ובדיקה עבור ACMA שכבתה (ירוק trace). מנהל בקרת ניסויים כמו בשלב 2, ערבוב, לדוגמה, PL ו SUV של אותם אישומים (אפורה מעקב).הערה: פרוטון שאיבה צריך להשתפר על ידי PL. postfusion 7. משלוח של חלבוני ממברנה LUV, בוס מאת Fusogenic Proteoliposomes נתיך µL 50 של PL+ עם 50 µL של 800 nm LUV– , 1 מ”ל של מאגר D בתוספת עם 1 מ MgCl2, 20 מ מ מתקרב, התחבאו במשך 5 דקות. גלולה השלפוחיות המוגלתיות ב 6,000 g x במשך 5 דקות, ולמחוק את PL unreacted המכיל supernatant+. Resuspend בגדר ב 1 מ”ל של מאגר D בתוספת 1 מ”מ MgCl2 ו- 100 מ מ אשלגן כלורי, וחזור pelleting ו- resuspending פעמיים יותר. הפעל ACMA שכבתה assay כפי שמתואר 5.2 או 5.4. הפעל את בקרת ניסויים, כמו שלבים 1-3, באמצעות שילובים של שלפוחית טעונה משלימים במלח גבוהה (200 מ מ אשלגן כלורי), שלפוחית fusogenic שאינם ריקים LUV– ללא PL+.הערה: פרוטון שאיבה מאת postfusion LUV שיזוהו רק כאשר שלפוחית complementarily טעון שימשו כפי שמוצג באיור 6. 8. הרכבה של רשת התחבורה אלקטרון מרכיבים בודדים ממברנות של אהובה, בוס, וייצור ATP על ידי שרשרת זו. הערה: תיאור סכמטי של הליך זה מודגם ב איור 7 א. ATP מיוצר בניסוי זה יהיה רשום על ידי מערכת luciferin-לוציפראז, איפה המרה של ATP מסונתז רב-תכליתי ואת המגבר מאת לוציפראז ואחריו פליטת אור רשום של luminometer. אנו ממליצים להשתמש luminometer של יחיד-שפופרת, במקום luminometers microplate פחות רגישים. לערבב 3 µL של bo3-אוקסידאז PL+ , 5 µL של F1Fo PL+ נוצר כמתואר בסעיף 4. . כן, המרעום אותם עם 3 µL של אהובה או בוס– (נוצר כמתואר בסעיף 2) ב- 800 µL מאגר D בתוספת 20 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2 למשך 5 דקות באמצעות ריכוז גבוה מניות, להוסיף אשלגן כלורי, המגבים הריכוז הסופי 100 מ מ ו-50 מ”מ לממברנות postfusion.הערה: במקרה של פוסט-פיוז’ן LUV, שלב זה ימנע שלהם נפיחות כתוצאה osmotic היסט בין החיצוני (מאגר A) ומלחים intravesicular (המאגר D) ריכוז. באופן אופציונלי, גלולה של ממברנות postfusion כמתואר ב- 7.2 כדי להפריד בין רכב שטח unreacted+, resuspend בגדר ב 800 µL מאגר א להכין 200 µL luciferin-לוציפראז-ADP קוקטייל המכיל 400 מיקרומטר ADP, 50 מיקרומטר luciferin ו 2.5 לוציפראז µg במאגר A הוסף את הקוקטייל לתערובת postfusion Step8.3. להוסיף 40 µM של תחמוצת קואנזים Q1, וכן לעורר energization פקיעת קרומים postfusion מאת bo3-אוקסידאז על-ידי הוספת 2 מ מ DTT. המתן 1 דקות. ליזום סינתזת ATP על ידי הוספת 5 מ מ אשלגן פוספט (KPאני, pH 7.4) שלפוחית אנרגיה, לזהות לייצור ATP luminometer, (איור 7 ב). הפעל את התגובה ~ 3 דקות.הערה: התגובה סינתזת ATP ממשיך למשך 5-7 דקות עד דלדול של החמצן הנצרך על ידי בו3-אוקסידאז, לוציפראז. להוסיף תקן הפניה ATP (0.5 nmol ATP) תערובת התגובה פעמיים. מדד ATP מיוצר. להשיג את הכמות בפועל של ATP מיוצר התגובה על ידי חלוקת האות מתגובה סינתזת ATP ע י האות סטנדרטי של הפניה ATP. להתאים בערך הסכום הכולל של1F Fo המשמשים את התגובה, ולבטא את סוף סוף קצב סינתזת ATP ב- µmol ATP / (מ”ג F1Fo* min).

Representative Results

השימוש fusogenic משלימים טעונה proteoliposomes למסירה מהירה ללא חומרי ניקוי של קרום חלבונים לתוך היעד bilayer ממברנות כוללת שלושה שלבים (איור 1): A, היווצרות fusogenic SUV של השומנים תערובות עם גבוה התוכן של ליפידים טעונה; אלה רכב שטח יכול לשאת באופן אופציונלי של עומס intravesicular; B, המרה של fusogenic SUV לתוך PL באמצעות שיחזור חלבון ממברנה מהר שלנו; C, פיוז’ן של fusogenic PL עם היעד bilayers במדיום מלח נמוכה, ואחריו תוספת של מלח גבוהה כדי לעצור את תגובתיות. במקרה של שלפוחית גדול (D), אסטרטגיה עדיפה היא לספק חלבון ממברנלי לתוך bilayer היעד anionic, אשר מספק סביבה טובה יותר השומנים לפעילות של חלבוני ממברנה (שנדונו עוד יותר בתוך הטקסט). פרוטוקול היווצרות בוס בשיטה הפוכה אמולסיה מודגשת בפירוט באיור2. אנחנו מעדיפים להשתמש hexadecane בתערובת שמן השומנים בשל שלה גבוה יחסית טמפרטורת הקיפאון (18 ° C), המאפשר הסרה קלה של שמן הקרושה לאחר בוס pelleting. איור 3 מדגים פיוז’ן שלפוחית בשיטת קובלט-calcein-EDTA. פיוז’ן נתפסת רק כאשר משלימים שלפוחית טעונה משמשים במאגרי מלח נמוכה, תוך ריכוז המלח גבוה (> 50 מ מ14) או השימוש הלא-fusogenic שלפוחית להדגים אין פיוז’ן. פרוטוקול זה מהיר של הכינון של קרום חלבונים לתוך fusogenic SUV מודגם ב איור 4A. באמצעות פרוטוקול זה, נדגים מהר הכינון של פרוטון העיקרי לשאוב בו3-אוקסידאז ו- F1Fo ATP סינתאז לתוך PL, והערכה של פעילות מסוימת שלהם ממברנות אלה. חשוב לציין התשואה של חלבון שיחזור אינה תלויה המטען של השומנים נעשה שימוש15 הוא כ- 50-75,12, כי לאחר שיחזור לתוך PL, החלבון ניתן לאחסן לפחות שלושה ימים, אפילו בטמפרטורת החדר ללא הפסד ברור של פעילות החלבון. הליך זה מספק גם הכיוון חד כיווני של ATP סינתאז, שבו יותר מ 95% ממנה יש שלה הידרופילית moiety F1 אוריינטציה כלפי חוץ,15,26. איור 5 מדגים את הפרוטונים שאיבה פעילות של F1Fo (פאנל A) ו- bo3-אוקסידאז (לוח ב’) בליפידים cationic הוא מופחת ורגישה נמוך כוח יונית, לעומת הסביבה השומנים anionic ונייטרלי, אבל אפקט זה הוא לפתור בתוך ממברנות postfusion לאחר פיוזינג PL+ עם אהובה anionic–. איור 6 מדגים משלוח של F1Fo ATP סינתאז לתוך הממברנות של שלפוחית גדול. הניסוי הזה, PL+ , 800 nm LUV– היו התמזגו ב 20 מ מ מתקרב, התחבאו במשך 5 דקות, ואת המוצר התגובה היה מגורען להסיר unfused PL+, resuspended, לבדיקה לשאיבת פרוטון. בקרת ניסויים הראו אין שאיבה פרוטון כאשר LUV0 במקום של סיגל גבעון– שימשו תגובתיות (trace שחור) או ריק LUV– לבד לבדיקה (כחול trace). הרכבה מהירה בשרשרת האלקטרונים תחבורה מתפקדת הממברנות של שלפוחית גדול על-ידי fusogenic PL מוצג איור7. השתמשנו F1Fo רכב שטח+ בו3 רכב שטח+ עבור פיוז’ן עם 800 nm LUV-, הדגימו ייצור ATP על ידי זה קשור בשרשרת השלפוחיות המוגלתיות postfusion על-ידי הוספת ברצף קואנזים Q1 ל- DTT כדי להמריץ את ממברנות ולאחר מכן הוספת פוספט לעורר סינתזה ATP מאת F1Fo. איור 1: תפיסת מרביים דטרגנט ללא מסירה של חלבוני ממברנה לתוך היעד bilayers שומנים בדם באמצעות היתוך של unilamellar שלפוחית יצרו של ליפידים טעונה משלימים. (א) היווצרות cationic ו anionic fusogenic unilamellar קטן שלפוחית (SUV+, רכב שטח–) לחלופין נטען עם מטענים intravesicular. (B) המרה של fusogenic SUV לתוך fusogenic proteoliposomes (PL) על ידי בנייתו מחדש של חלבוני ממברנה. (ג) דטרגנט ללא מסירה של חלבוני ממברנה לתוך ממברנות postfusion עם אסטרטגיה עדיפה PL. (ד) fusogenic למסירה של קרום חלבונים לתוך הממברנות של שלפוחית גדול, מאויר על ידי המיזוג בין 100 ננומטר PL+ 800 nm סיגל גבעון–. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: בוס פרוטוקול היווצרות עם שיטת אמולסיה הפוך. (א) היווצרות טפט השומנים על הגבול שבין תערובת שמן-השומנים והמים. -צורה של תחליב (מים בתוך שמן) הפוך (B). (ג) בוס צורה על-ידי העברת האמולסיה דרך הגבול שמן מים בעזרת צנטריפוגה. (ד) קירור של הצינור מתחת < 18 ° C כדי לחזק ולהסיר את השמן. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אי) A של בוס המכיל שומנים פלורסנט (1% משקל שבר cholesteryl-Bodipy-FL12) הממברנה שלו (ירוק), fluorophore הקוטב (1 מ מ Sulforhodamine 101) לומן של שלפוחית (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: פיוז’ן שלפוחית השומנים למד את שיטת קובלט-calcein-EDTA. תיאור סכמטי של השיטה, איפה calcein חינם הוא שוחרר מן מתחם הלא-פלורסנט קובלט-calcein על ידי EDTA (A). (B) פיוז’ן של רכב שטח בריכוזים שונים של אשלגן כלורי. (ג) פרסום calcein intravesicular על ידי תוספת של EDTA, טריטון X-100 ניקוי postfusion שלפוחית שמוצג ב’ כפי שמתואר בטקסט. היקף פיוז’ן (%) עבור מעקב אדום הוא מחושב על ידי חלוקת האות פיוז’ן מתוקן-רקע מקסימלי (1 – 2) ע י מתוקן-רקע מקסימלי האות בעקבות שחרורו של calcein שעברו אנקפסולציה (3-2) והכפלתם במאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: מרביים להתחדשות ומבנה של bo3-אוקסידאז ו- F1Fo לתוך fusogenic proteoliposomes, חלבון מידות פעילות כזו proteoliposomes. תיאור סכמטי של פרוטוקול למפת (A). חמצון1 (B) קואנזים Q מונע פרוטון שאיבה ב- bo3-אוקסידאז ב PL נמדד עם ACMA שכבתה (הסביר בטקסט). (ג) ATP מונחה הידרוליזה פרוטון שאיבה מאת1F Fo ב- PL נמדד עם ACMA שכבתה (הסביר בטקסט). (ד) ATP הידרוליזה על ידי1F Fo ב- PL נמדד עם מערכת ATP-רגנרציה (הסביר בטקסט), גירוי שלה על ידי uncoupler. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5: השפעתה של השומנים הסביבה ועל כוח יונית על הפעילות של קרום חלבונים. פרוטון שאיבה מאת F1Fo (A) ו- bo3-אוקסידאז (B) cationic PL (trace אדום), anionic PL (trace כחול), נייטרלי PL (שחור trace) ו cationic PL התמזגו עם אהובה anionic (ירוק trace) ב- 20 ו- 100 מ מ (מעקב בקרת אשלגן כלורי. אפור) מציג ללא שינוי פרוטון שאיבה ב- F1Fo PL– על ערבוב עם רכב–. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6: מסירת F1Fo ATP סינתאז לתוך ממברנות של 800 nm LUV– באמצעות היתוך עם PL+. (א) תיאור סכמטי של הניסוי: PL+ ו-800 ננומטר LUV– היו התמזגו ב- 1 מ מ מגבים (pH 7.4), 1 מ MgCl2, 20 מ מ מתקרב, התחבאו במשך 5 דקות, מגורען להסיר unfused PL, resuspended במאגר אותו. פרוטון (B) שאיבה מאת אהובה postfusion (trace אדום). בקרת ניסויים הראו אין ACMA שכבתה PL0 , מעורבים עם אהובה– (סימן שחור), או ריק LUV– לבד היו לבדיקה (כחול trace). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 7: 5-מין ללא דטרגנט הרכבה של שרשרת האלקטרונים תחבורה בתוך ממברנות של 800 nm LUV– באמצעות היתוך עם PL+. (א) תיאור סכמטי של הניסוי: 100 ננומטר F1Fo PL+ ו- 100 ננומטר בו3-אוקסידאז PL+ היו התמזגו עם אהובה-, כמתואר באיור 6. פיוז’ן הופסקה על-ידי הוספת אשלגן כלורי MOPS 100 ו- 50 מ מ, בהתאמה. הממברנות היו מעורבבים עם ADP-luciferin-לוציפראז קוקטייל, אנרגיות תוספת של DTT ו- Q1, כפי שתוארה בטקסט. ייצור ATP הופעל על-ידי תוספת של 1 מ מ פוספט (Pאני) תחת פיקוח בזמן אמת עם מערכת לוציפראז-luciferin כפי שתוארה בטקסט. סינתזה (B) ATP על ידי שלפוחית postfusion (trace אדום). בקרת ניסויים הראו אין ייצור ATP PL+ , מעורבים עם אהובה– במלח גבוהה (אפור), או PL0 , מעורבים עם אהובה– (שחור). קצב סינתזת ATP מחושב כפי שמוסבר בטקסט (שלבים 8.8-8.9). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

להלן כמה בעיות צריך להיחשב להצלחה של גישה זו ניסיוני:

הבחירה של השומנים תשלום עבור bilayers proteoliposomes ואת היעד: ליפידים cationic לא יימצאו בטבע, ואילו שומנים anionic הם בשפע מחקר ביולוגי, להגיע, לדוגמה, ~ 25, 35 ו- 20% בקרום הפנימי של e. coli, קרום פלזמה של שמרים cerevisiae סולאחר הממברנות מיטוכונדריאלי הפנימי של מינים רבים, בהתאמה27,28,29. זה יהיה סביר לצפות כי הפונקציונליות של חלבוני ממברנה ב PL+ עשוי להיות מושפע הכוח של מטען חיובי של bilayer, אשר בתורו תלוי תוכן היחסי של cationic השומנים את bilayer וחיצוניים יוניים כוח. לכן, חשוב להתייחס השפעול באיזו מידה הפונקציונליות של חלבוני ממברנה עניין תלוי המטען של הסביבה cationic השומנים. . הנה, אנחנו מראים כי שני F1Fo ATP סינתאז ובו3-אוקסידאז רגישים לסביבה cationic השומנים, אבל הצלחנו לווסת, להפוך את האפקט הזה על-ידי הצבת את החלבונים PL+ הראשונה, להעביר אותם לתוך anionic קבלת bilayers ולאחר מכן העלאת החוזק יוניים של המדיום התגובה לאחר היתוך הוא סיים.

הבחירה של ליפופרוטאין cationic מסוים: ליפידים cationic הנמכרים ביותר הם של הטבע הלא-triacylglyceride; לכן ליפופרוטאין המועמד הפוטנציאלי חייב להיבדק לתאימות עם קרום חלבונים עניין. מצאנו קודם לכן15 ATP סינתאז השתמשו במחקר זה הראה שאת הביצועים הטובים ביותר שלה ב- PL+ יצרו של אתיל-PC, שבו יש את קווי הדמיון המבני הגבוהה ליפידים triacylglyceride טבעי, בעוד DOTAP (הלא-triacylglyceride השומנים) PL+ חלבון זה היה פחות פעיל.

שלפוחית פיוז’ן מבחני: פיוז’ן אמיתי שלפוחית (כאשר תוכן נוזלי intravesicular לערבב) צריך להיות מבודלים ממדינות המי-fusion ביניים, כאשר שלפוחית לדבוק אחד בשני ללא ערבוב תוכנם מימית, אבל ברצון לערבב תוכן החיצוני שלהם או שניהם שומנים בדם כרוזים30. במקרה של השומנים שיוצרת תערובות או בתנאים מסוימים, שלפוחית גם להוכיח בולטת זליגת תוכן נוזלי במהלך פיוז’ן31. ריכוז מינימלי של ליפידים טעון ב תערובות fusogenic המאפשרים פיוז’ן אמיתי צריך להימצא השפעול עבור כל המינים השומנים, אבל באופן כללי, הוא נמצא כי ממברנות עם פחות מ- 10% מחויב ליפידים מעובדים שאינם fusogenic 32.

תוך יצירת fusogenic SUV בנוכחות של רב-עמודים ולנטיין יונים, חשוב לא לערבב רכיבים טעונים הפוך, כמו זו עלולה לגרום clumping מיידית, צבירה של שומנים על ידי יונים אלה. לדוגמה, בעת הכנת רכב שטח עבור שיטת קובלט-calcein-EDTA, חשוב למנוע ערבוב את תערובת השומנים cationic עם EDTA כדי למנוע סתימת של המסנן פוליקרבונט על-ידי רכיבי גושית.

חשוב גם לציין כי שיטת קובלט-calcein-EDTA, בעת היותו רגיש מאוד ונוח לניטור היתוך בזמן אמת, ייתכן עדיין להמעיט את היקף פיוז’ן בשל 1) שכבתה עצמית של זריחה של calcein חינם בתוך שלפוחית postfusion, אשר צפוי להגיע 1 מ”מ, ואילו הסף quenching עצמית הוא דיווח כי בסביבות 20 מיקרומטר33, ו- 2) משטח מכורך קובלט-calcein, אשר נשאר מאוגד ל SUV+ אפילו אחרי שעברו דרך השרף ג’ל-סינון ו צבעים שלפוחית לצבע כתום בהיר, כל רכב שטח0 יש צבע כתום חיוור. שימו לב גם כי שחרורו של קובלט מאוגד-calcein עם תוספת של דטרגנט טריטון X-100 בנוכחות EDTA יוצר אותות הרבה יותר חזק עבור רכב שטח+ (איור 3C, מעקב אדום) מרכב שטח0 (אפורה מעקב).

פרספקטיבות: אנו מצפים כי הגישות מהר המתוארים כאן יכול מאוד להקל ולהאיץ הרכבה של ממברנות מורכבות לצרכי המתעוררים יישומים בביולוגיה סינתטית. פרוטוקול למפת שלנו חלבון ממברנה לוקח רק חצי שעה בשביל שיחזור של חלבונים שבירים רפידה גדול ידוע להיות רגישים טכניקות שיחזור מבוסס-דיאליזה ארוך, בעוד גישה fusogenic זו לוקח רק 5-10 דקות כדי לספק חלבונים כאלה לתוך השומנים גדול bilayers. . הנה, נדגים את היתרונות של גישות אלה על-ידי מניפולציה e. coli F1Fo ATP סינתאז, המהווה דוגמה של חלבון שביר. זה עשוי 23 subunits, ידוע בקלות לאבד את תקינותו אם חשופים לתנאי שיוצרת (לדוגמה, חום) במהלך/אחרי solubilization, אך נעשה שימוש בהליכים אלה, החלבון מדגים פעילות reproducibly גבוה שאיבת פרוטון.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים רוברט Gennis אוניברסיטת אילינוי, כריסטוף פון Ballmoos מ אוניברסיטת ברן עבור מתן של פלסמיד זן לבטא בו3-אוקסידאז. הפרויקט נתמך על ידי BBSRC להעניק BB/L01985X/1 מהיסודות, R.B.

Materials

DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Buffers used in the paper Composition
Name Company Catalog Number Comments
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).
  2. Johnson, M., et al. Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods Mol Biol. 955 (31-58), 31 (2013).
  3. Dezi, M., et al. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Nat Acad Sci U S A. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  4. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 87 (1), 419-429 (2004).
  5. Angelova, M., et al. Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields – Kinetics and Applications. Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).
  6. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  7. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-Like Printed Material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  8. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet. 11 (5), 367-379 (2010).
  9. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lett. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  10. Church, G., et al. Realizing the potential of synthetic biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (4), 289-294 (2014).
  11. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  12. Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 5, 4303 (2014).
  13. Decout, A., et al. Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372 (1), 102-116 (1998).
  14. Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (4), 979-984 (2009).
  15. Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes. Nat Commun. 7, 13025 (2016).
  16. Biner, O., et al. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 590 (14), 2051-2062 (2016).
  17. Bian, T., et al. Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 481 (3-4), 206-211 (2016).
  18. Schuette, C. G., et al. Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 2858-2863 (2004).
  19. Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics. J Vis Exp. (80), e51304 (2013).
  20. Verchere, A., et al. In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. J Vis Exp. (84), e50894 (2014).
  21. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10. Analytical Biochemistry. 150 (1), 97-104 (1985).
  22. Rumbley, J., et al. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochim Biophys Acta. 1340 (1), 131-142 (1997).
  23. Taussky, H. H., Shorr, E. A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 202 (2), 675-685 (1953).
  24. Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (3), 206-214 (2006).
  25. Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1706 (1-2), 110-116 (2005).
  26. Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases. Biochim Biophys Acta. 1777 (10), 1301-1310 (2008).
  27. Morein, S., et al. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem. 271 (12), 6801-6809 (1996).
  28. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  29. Daum, G., Vance, J. E. Import of lipids into mitochondria. Prog Lipid Res. 36 (2-3), 103-130 (1997).
  30. Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers. J Membr Biol. 170 (1), 27-38 (1999).
  31. Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles. J Membr Biol. 194 (2), 129-139 (2003).
  32. Sunami, T., et al. Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter. Langmuir. 26 (19), 15098-15103 (2010).
  33. Memoli, A., et al. Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 627-632 (1999).

Tags

Membrane ProteinsLipid BilayersFusogenic ProteoliposomesDetergent-freeReconstitutionArtificial CellMembrane TransportSynthetic Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik, S. B., Berry, R. M., Ishmukhametov, R. R. Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.. J. Vis. Exp. (134), e56909, doi:10.3791/56909 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image