X 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と PBMC

次のプロトコルは、健常人血中撤退を含まれます。ドナーには、入学前に書面によるインフォームド コンセントが用意されています。この手順はヘルシンキ宣言に従って、血引き出し専門の医療アシスタントによって実行されていました。 1. 細胞培養と培養セットアップ 1 週間、照射前に、mL の 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 ミリメートル L グルタミン、100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシンと新鮮な RPMI1640 培/2.5 × 105細胞を含む細胞懸濁液カコ 2 を準備します。 種子滅菌 1 μ m 孔径細胞培養の細胞懸濁液 2 mL 6 ウェル プレートの挿入、挿入 6 ウェル プレートに。注: セル文化挿入は、培養細胞の播種前に完全培地滅菌でアクティブにする必要があります。この場合、文化メディアを破棄され、細胞懸濁液媒体を交換する必要があります。 10 s、2 mM L グルタミン、100 IU/mL ペニシリン各下部コンパートメントの 100 μ g/mL ストレプトマイシンと新鮮な RPMI1640 培の 3 mL を加えるし、5% CO2を含む加湿雰囲気のインキュベーターで 37 ° C で培養します。 カコ 2 細胞照射の同じ日、市販リチウム ヘパリン コーティング 6 mL チューブでひと全血を収集 (チューブのサイズ: 13 × 100 mm)。 その後、Ficoll のグラデーションを用いた末梢血単核球 (PBMC) を分離します。50 mL の円錐形遠心管と層全血の等量で Ficoll の 25 mL を入れ、PBMC を分離 Ficoll サーフェイス RPMI1640 と 1:1 希釈。注: 通常健康なドナーは通常約 4-10 × 10 6/mL の PBMC を持っています。 室温で 30 分間 400 x g で 50 mL のチューブを遠心します。 優しく Ficoll とプラズマのパスツール ピペット吸引により界面 PBMC を収集し、15 mL の円錐管に入れてください。 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を追加し、PBMC を 10 分間 250 × g で遠心分離によって 2 回、PBMC を洗います。 文化 PBMC T25 で 3-5 h の最大の cm2フラスコで完了 RPMI1640 媒体、37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で、前に説明したよう。注: は、実験の日に PBMC を収集し、シード 2 × 106細胞/ウェル、3 mL の共培養の底部のコンパートメントで、完全の RPMI1640 培で中断します。Caco-2 細胞を挿入は、その照射後 PBMC 含む井戸 30 分で転送されます。全血から収集した PBMC できない以上約 72 時間、文化で維持されない例えば刺激。な (PHA) は、細胞の生存率が失われました。注意: すべての血液や血液製剤の安全性と品質は、プロセス全体を通して保証されなければなりません。 2. 照射設定 注: caco2 細胞の照射は、異なったタイプの癌を治療するために定期的に使用される線形加速器の Istituto ・ ディ ・ Ricovero 電子クーラ Carattere Scientifico (IRCCS) s ・ モージュ (パヴィア、イタリア) の放射線治療部門で行われました。 6 MV ピークに光子 x 線エネルギーを設定します。線形加速器パルス政権で動作 (4 ms の約 2 つの連続したパルス間の時間; 線量で 5 μ s の単一パルスの期間率は最大 1 × 10-3 Gy/p)。 カコ 2 1.4 cm 厚プレキシ グラス (使用される放射線の蓄積よりも少し大きな距離に対応する) でシート 100 cm 放射の源からの x 線の軌道上の挿入を含む 6 ウェル プレートを配置します。 照射の前に後方散乱放射成分と荷電粒子平衡を保証する各サンプルに 0.5 cm の厚さの塊を配置します。 セルに照射 (2-10 Gy の範囲で用量) フラットと対称 (± 2%)20 × 20 cm2放射フィールド、3 Gy/分の線量率。注: 制御「シャム」-照射細胞照射室に入ることがなく、照射物の同じ手続き型条件を施行した (受け取られた線量: 0 Gy)。注意: 電離放射線を生み出す装置は専門スタッフによってのみ使用する必要があります。 3. セル実行可能性の試金 (MTT の試金) 注: カコ 2 細胞代謝活性は 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ブロマイド (MTT) アッセイ14によって評価しました。 シード 2 × 105カコ 2 24 ウェル プレート 24 h で 1.25 mL の完全培地の照射前に。 2.1 2.4 の手順で説明するよう細胞に照射し、37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で細胞をインキュベートします。 照射後 21 h を 5 mg/mL の MTT 溶液を 100 μ l 添加し、37 ° c 3 時間 5% CO2を含む加湿雰囲気で細胞を維持します。 上澄みを廃棄し、1 ml の PBS のセルを洗浄してください。 各ウェル内のジメチルスルホキシド (DMSO) 500 μ L を追加することで塩の結晶を溶解し、λ のウェル プレート リーダーで吸光度を評価 = 570 nm。 照射後ステップ – 3.3 3.4 3.5-3.6 45 h を繰り返します。注: 結果は、100% に正規化された対応する偽状態から摂動として表示されます。注意: DMSO は引火しやすいおよび刺激剤皮膚、目、呼吸器系 (GHS07、GHS08 です)。目に接触した場合豊富な水で十分に洗い流して、医師の診察。MTT は、皮膚、目、呼吸器系 (GHS07、GHS08) の刺激剤です。目に接触した場合直ちに多量の水で洗浄し、医師の診察。 4. 生菌測定 (トリパン ブルー色素排除試験) の割合 注: 実行可能な細胞の割合は、トリパン ブルー色素排除法によって評価されました。 シード 2 × 105カコ 2 24 ウェル プレート 24 h で 1.25 mL の完全培地の照射前に。 0 の範囲内の用量で細胞を照射 – 10 Gy (手順 2.1 2.4 参照)、37 ° c 24-48 h の 5% CO2を含む加湿雰囲気でセルを孵化させなさい。 2 つの選ばれた時ポイント、PBS のセルを洗浄して、それを破棄し、トリプシン エチレンジアミン edta 溶液を 100 μ l 添加します。37 ° C でセルを入れて 2 分間 5% CO2を含む加湿雰囲気し、酵素反応を阻止する完全培地を追加します。 1.5 mL チューブに細胞を収集し上澄み 500 x g で 5 分間破棄でチューブを遠心し、50 μ L の PBS のセルを再停止します。 細胞懸濁液を混ぜてトリパン ブルー色素溶液を 50 μ l 添加し、室温で 3 分間混合物を孵化させなさい。 ステンド_グラス カウント (現実的な) Bürker 室 (実行可能な) セルを無染色。 5. トランス上皮電気抵抗 (TEER) シード 5 × 105カコ 2 セル 6 ウェル プレートに照射する前に 1 週間共培養 (ポリエチレンテレフタラート (PET) 2 x 106毛穴/cm2) の挿入。 照射直前に 1 h を測定電圧計/オームと TEER。 手順 2.1 2.4 では、細胞を照射します。 37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で PBMC 共培養の有無で caco-2 細胞を孵化させなさい。 最初数時間後照射測定 TEER 毎の時間とその後 48 時間まですべての 3 h。 6. 西部のしみのクローディン 1、オクルディン、Afadin、ZO 1、ZO-2 の解析、Nf-kb など XIAP シード 5 × 105セル 6 ウェル プレート共培養における x 線暴露の前に 1 週 (ペット、2 × 106毛穴/cm2) を挿入し、手順 2.1 2.4 で説明されているように細胞を照射します。 37 ° c 5% CO2を含む加湿雰囲気で PBMC 共培養の有無で caco-2 細胞を孵化させなさい。 照射後 48 h 準備カコ 2 と PBMC セル lysates セル換散とセルを扱うことによってバッファーに格納し、-20 ° C で試料を保存注: プロトコルはここで一時停止することができます。 ビシンコニン酸 (BCA) 法による総蛋白量を定量化します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 総蛋白の同量を混ぜて β-メルカプトエタノールを追加 Laemli サンプル バッファー (β-メルカプトエタノールの最終濃度は 5%)、95 ° C、5 分でサンプルを加熱し、10,000 x g でそれらをスピンします。 ロード 4-20% のサンプルはゲルをプレキャストし、polyvinildiene ビニリデン (PVDF) 膜の 1 h. 転送蛋白質の 120 V で電気泳動を行います。 5% 脱脂乾燥したミルク (NFDM) PBS の 0.2% に追加で室温で PVDF 膜の孵化によって非特異的結合部位をブロック トゥイーン 20 (PBT)。0.2 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。 次の一次抗体の 4 ° C で一晩に配置されている前に室温で 1 時間穏やかな攪拌と膜を孵化させなさい: 反クローディン 1、アンチ ZO 1、アンチ ZO 2、反 afadin、アンチ オクルディン、抗 NF kB、アンチ XIAP、および抗アクチン。0.2 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。 穏やかな攪拌と室温で 1 h の西洋わさびペルオキシダーゼ HRP 標識二次抗体と膜を孵化させなさい。0.2 mL で 3 回膜を洗って 5 分 PBT です。 常温で強化された化学発光キットと膜の孵化によって写真フィルムを開発します。 写真フィルム スキャン システムを取得して適切な画像解析ソフトで得られたバンドを定量化します。注: ZO 2、ZO-1 Afadin Occludin クローディン 1 の評価は、caco-2 細胞で実行されます。PBMC で Nf-kb など XIAP の評価を行います。注意: β-メルカプトエタノールは有毒である (GHS05、GHS06、GHS08、GHS09)。蒸気を呼吸に、環境への放出を避けることし、個々 の保護デバイスと呼吸用保護具を着用しません。飲み込んだ場合は、すぐに医学的なアドバイスを求めます。 7. 統計解析 放射線被ばくと共培養が統計的に有意な摂動を誘発するかどうかを確認するのに繰り返し測定のため (ボンフェローニ事後テストを比較するとの双方向の分散分析 (ANOVA) 多重比較テストを実行する.複製を意味)。 記載のない場合は、2-スチューデントの両側 t 検定で有意 (p) を計算します。各値は、3 の独立実験 ± 標準誤差の意味 (SEM) の平均値です。