ポータブル リアルタイム PCR を用いた土壌伝染性植物の敷地内の分子の検出

DNA 抽出法の比較 磁気ビーズを用いた DNA 抽出法のリアルタイム PCR との互換性は、病原体がはびこるフィールドからの土のサンプルのS. 病菌DNA の量を検出することにより評価しました。磁気ビーズ法が基づく CTAB-フェノール-クロロホルム法18など迅速な DNA ミニ準備方法19、20、その他他の方法と比較した補足図 1のように、標準的なシリカ系 DNA 抽出キット。六つの異なるメソッドを使用して抽出した DNA 試料は、従来の研究室ベースのリアルタイム PCR に服従しました。シリカ系 DNA 抽出キットは、我々 はテスト方法の中で最高のパフォーマンスを示したが、磁気ビーズ法は他の方法に匹敵することが示唆されました。すべてのキットに含むためまたはため塩酸: RNases や Dnase など細胞の蛋白質のほとんどを変化させなさい強力なカオトロ ピック剤にも。したがって、メソッドを使用して DNA や RNA の抽出に適しています。 ポータブル リアルタイム PCR と従来研究室ベースのリアルタイム PCR の比較 従来研究室ベースの PCR、DNA は pGEM T ベクトル21 によって運ばれたジャガイモ根部より s.その遺伝子の量が異なるを使用して実行された病原体の絶対定量にポータブル PCR の特異性と感度を比較するには.その遺伝子の 10 倍希釈液のシリーズ (106 100枚) SsTQ プライマー ・ プローブ セット22を用いて分析を行いました。ポータブルの PCR 法に対象病原体の DNA が検出されたことがわかった (〜 100 のコピー)、感度は 10 倍より低い従来の研究室での PCR 法の少なくとも 10 枚 (図 2) を検出します。 さらなる検証のため人工的に出没する土壌を調べた。S. ジャガイモsporosori 粉状そうか病ルートえいポテトの根から得られました。土壌は、土の 10 の5 sporosori/g 乾燥重量の最終的な集中で sporosori の懸濁液にはびこっていた。磁気ビーズ法を用いた、出没の土壌サンプルから DNA が抽出され、10 倍連続希釈濃度に相当する 10 を取得する準備された5104103102101、および 100sporosori/g 乾燥土の重量。DNA サンプルは、SPO プライマー ・ プローブ セット23を使用して PCR を使用しました。結果、ポータブルの PCR 法は従来の研究室での PCR 法に匹敵する解析機能ですが、再び、感度は ~ 10 (図 3) の要因によって減った。 最後に、我々 は自然米病菌に汚染されていたフィールドからの土のサンプルをテストしました。磁気ビーズを用いた DNA の抽出は、土壌 (土壌抽出緩衝液 500 μ L あたりの 10、20、50、100 mg) の異なる量で実行されました。DNA の抽出のための開始材料としての土の最適な重さが 50-100 mg (図 4) であることが示唆されました。範囲外の土壌量下流の PCR のステップの故障の原因。この効果は、開始材料として土の過剰な量を使用する場合 (例えば、フェノール化合物) の汚染できる PCR24を妨害するためかもしれない。土の下のボリュームの場合抽出した DNA の量が (例えば10-20 mg の土壌から抽出された DNA を変化させた合計収量) PCR 検出限界よりも低い可能性があります。感度はまったくポータブル PCR および従来の PCR 法間で比較しました。異なる抽出方法 (補足図 2) によって DNA のサンプルで同様の結果が得られました。 ポータブル リアルタイム PCR を用いたオンサイト検出システムによって他の病原体の検出 R. solani AG3 と PMTV 他重要な土壌媒介ジャガイモの病原体を検出する携帯用の PCR 法をテストしました。本研究では純粋培養から dna R. solani AG3 検出 RsTq プライマー/RQP1 プローブ セット25を使用してリアルタイム PCR を行った。また、リアルタイム PCR を用いた PMTV D プライマー ・ プローブ セット26 PMTV ガストンネル症候性塊茎サンプルから RNA 検出のために使用された行った。図 5のように、ポータブルの PCR 法は正常に両方の病原体を検出しました。結果は、ポータブルおよび従来の器具は、リアルタイム PCR 用に設計されたプライマー シーケンスが使用可能な場合はポータブルの PCR 法、汎用性と他の病原体の検出に適用できることを示唆している間で同等だった。 図 1。オンサイト病原体検出のための携帯用リアルタイム PCR システムのプロシージャ。プロトコルは次の順序での手順で構成されます: 簡単な均質化 (A)、磁気ビーズを用いた核酸抽出 (B)、携帯用リアルタイム PCR (C) およびラップトップ コンピューター (D) を用いた定量的データ解析によるライセート作製。サイト上のすべての手順を実行できることに注意してください。 図 2.ポータブル PCR と従来の研究室の PCR の感受性の比較。病原体の DNA の定量化を行った米ジャガイモその遺伝子の量が異なるを使用して (106 100枚) SsTQ プライマー ・ プローブ セットします。S. ジャガイモプラスミド DNA のログ値と従来のたち (A) と (B) のポータブルのたちの Cq の相互のログ値間の線形回帰。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3.人工的に出没する土壌の検出性能の比較ジャガイモ根部より s..土壌が人工的に出没 (105 100 sporosori/g 乾燥土の重量) s. ジャガイモsporosori 懸濁液を。磁気ビーズ法を用いた、DNA が出没する土壌試料から抽出されました。SPO プライマー ・ プローブ セットと土壌試料を用いた Pcr を行った。土壌 1 グラムあたり sporosori で開始量のログ値と従来のたち (A) と (B) のポータブルのたちの Cq の相互ログ値間の線形回帰。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4.DNA の抽出のための土壌試料の量を開始の比較。磁気ビーズ法は、10、20、50、および土壌試料の 100 mg からの DNA 抽出に使われました。ポータブルたちを使用してリアルタイム Pcr を行った。標準的なカーブは (x 軸) の土壌サンプルから抽出した総 DNA の量と Sss のプライマー ・ プローブ セットによって増幅される PCR の製品 (y 軸) の量との関係を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5.他のジャガイモの病原体の検出 R. solani と PMTV 。ポータブルたちと従来のたちを使用してリアルタイム Pcr を行った。R. solani AG3 RsTq プライマーと (A) PMTV PMTV 感染塊茎サンプル使用から抽出されたトータル RNA PMTV D プライマー ・ プローブ セット (B) 検出された RQP1 プローブを使用して純粋培養から抽出した合計の DNA で検出されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6.植物の診断パイプライン。フローチャートは、植物病原体診断の一般的なワークフローを示します。敷地内の分子の検出が利用されている診断の全体のプロセスは、シンプルかつ高速な場合に視覚的な識別など、伝統的なステップが省略できます注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 ポータブル リアルタイム PCR リアルタイム PCR ランプ ELISA 横流 ターゲットの反応あたりの費用します。 0.60 ドル-$ 8.47 $ 0.60 $ 0.75 $ 0.60 $ 4.74 感度 100 枚のコピー 10 枚 10 枚 1-10 sporosori331-10 ng/mL (タンパク質)33 1-10 sporosori345 x 105CFU/mL35 時間費用 90 分 80-240 分 50-90 分32 3 24 時間 10-15 分 準備が必要 ●Nucleic 酸抽出● プライマーの設計 ●Nucleic 酸抽出● プライマー ・ プローブ設計 ● Nucelic 酸抽出● プライマーの設計 ● 蛋白質の抽出● 抗体 N/A 必要なその他の材料 ● ポータブルたち ● 従来たち ● カラー メトリック汚れ● インキュベーター ● プレート リーダー● 洗浄装置 N/A 表 1。植物の分子および血清学的検出法の比較表 プライマー シーケンス (5 ‘-3 ‘)、 ターゲットb SsTQ F13 CCGGCAGACCCAAAACC S. 根の its 1 領 ITS2 SsTQ R13 CGGGCGTCACCCTTCA S. 根の its 1 領 ITS2 SsTQ P13 [ファム]CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [タム] S. 根の its 1 領 ITS2 Genesig S.subterraneaプライマー ・ プローブ N/A S. 根のアクチン SPO1014 GGTCGGTCCATGGCTTGA S. 根の ITS SPO1114 GGCACGCCAATGGTTAGAGA S. 根の ITS SPOPRO114 [ファム]CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [タム] S. 根の ITS RsTqF119 AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT R. solaniの its 1 領 ITS2 RsTqR119 AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT R. solaniの its 1 領 ITS2 RQP119 [ファム]TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [タム] R. solaniの its 1 領 ITS2 Genesig PMTV プライマー ・ プローブ N/A PMTV で CP RT PMTV-D-F20 AGAATTGRCATCGAAACAGCA PMTV CP PMTV D R20 GTCGCGCTCCAATTTCGTT PMTV CP PMTV D P20 [ファム]CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [タム] PMTV CP 、オリゴ DNA のプライマーは FAM (6-carboxyfluorescein) またはタム (5-carboxytetramethylrhodamine) に変更されました。 bITS: 内部転写スペーサー、CP: コート蛋白質;CP-RT: コート蛋白質リードスルー 表 2。本研究で使用されるプライマー 補足図 1。粉状そうか病の病原体の検出のための DNA 抽出法の比較。粉状そうか病病原体、 S. 根部土壌試料中の検出 6 異なる DNA 抽出方法 (A ~ F) を比較しました。(B、D、F)。シリカ系キット #1 を使用して DNA の抽出 (キットのすべての名前のための材料の表を参照)、シリカ系キット #2 と磁気ビーズ ベース キット、repsectively。従来の研究室での PCR たちを使用して PCR を行った。標準的なカーブは、土壌試料や SsTQ のプライマー ・ プローブ セットによって増幅される PCR の製品の量から抽出した総 DNA の量の間の関係を表します。この図をダウンロードするここをクリックしてください。 補足図 2。ポータブル PCR と従来の研究室の PCR 検出限界の比較。総 DNA から分離された 3 つの異なる抽出方法を使用して土壌サンプル: (, B) ドイル法、(C, D) シリカ系キット #2 および (E, F) 磁気ビーズを用いたキット。左側のデータで使用しているポータブルたち Sss のプライマー ・ プローブ セット、右側のグラフを表す SsTQ プライマー ・ プローブを用いた従来の研究室でのたちを使用して生成されたデータを表示するグラフを設定します。この図をダウンロードするここをクリックしてください。