상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에
Summary
여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.
Abstract
이 작품의 목표는 일부 immunomodulatory 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어) 셀 마이그레이션 자극 등의 능력을 평가 하는 새로운 방법을 보여줍니다. 중요 한 것은, 셀 마이그레이션은 속도 제한 이벤트를 조직 계층의 일반 기능과 무결성 손상 후 상처 치유 과정. 셀 단층에서 수동으로 만든된 스크래치에 기반은, 고전적인 분석 결과,이 방법의 장점은 특별 한 실리콘 문화의 사용 삽입 필드를 만드는 한 셀-무료 의사 상처 잘 정의 된 폭 (500 μ m 2 개의 구획을 제공 하는 ). 또한, 자동된 이미지 분석 플랫폼으로 그것은 빠르게 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도에 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 더 정확 하 게, 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 두 개구리 피부 앰프의 효과가 표시 됩니다. 또한, 특정 억제제와 이러한 셀의 전처리 등 기본 분자 메커니즘에 정보를 제공 합니다.
Introduction
동물에서 상처 치유 하는 것이 부상1무결성 및 조직 층의 정상 기능을 다시 설정 하는 기본 프로세스는 크게 알려져 있습니다. 물리적, 화학적 모욕에서 보호 장벽을 형성 상피 표면 외부 환경 (예를 들어, 호흡기, 피부 및 위장 책자)에 노출에 불구 하 고, 상처의 형성 수 있습니다 쉽게 발생 하는, 특히 후 수술 또는 미생물 감염2. 예를 들어, 기회 주의 세균성 병원 체 녹 농 균, 특히 낭 성 섬유 증 (CF) 환자에에서 의해 폐 조직의 식민 이끌어 낸다 필연적인 호흡3, 기도 상피 세포의 손상 4. 상처 치유 부상된 조직5의 정상적인 구조를 복원 하는 복잡 한 호스트 복구 메커니즘입니다. 그것은 초기 염증, 포괄 epithelialization, 신생, 콜라겐 생산 및 세포 분화6,7,8 개장 하는 조직 재생 기간 다음에 의해 특징 . 상피의 무결성을 보장 하 고 미생물 증식 제어 모든 살아있는 유기 체 방어 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어)9,10를 포함 하 여 생산. 상처 치유 과정은 체 외에서 세포 파편 및 다른 세포 유형 사이 복잡 한 상호 작용의 부족으로 인해 시뮬레이션 하기 매우 어렵습니다. 그러나, 생체 외에서 의 능력 펩 티 드를 자극 하 여 의사는 상처의 폐쇄를 가속 상피 세포의 손상 된 상피 세포를 치유 하는 능력의 지표입니다. 실제로, 셀 마이그레이션 상처 치유, 속도 제한 이벤트 이며 향상 된 상처 치유에 대 한 대상 치료에 도움이 될 것입니다 공부 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 수 있는 요인.
여기, 높은 재현성 실험 분석 결과 셀 마이그레이션 시험관을 평가 하기 위해 특수 실리콘 문화 삽입에 따라 제공 됩니다. 그것은 500 μ m 간격 (의사 상처)에 confluent 셀 단층의 생성을 기반으로 합니다. 인공 “상처” 필드의 가장자리에 셀 셀 없는 지역으로 이주, 새로운 셀 연락처 형성 시작 됩니다. 문화 삽입 빠른 상처 치유 실험을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 500 μ m 벽으로 구분 된 두 개의 저수지 제공 됩니다, 그리고 그들이 배치 될 수 있습니다 제대로 3 cm 접시 접시 또는 12-잘 접시의 우물에서. 세포 현 탁 액으로 삽입의 각 구획을 작성 하면서 삽입의 제거 (분리 벽으로 동일한 폭) 약 500 μ m의 깨끗 한 셀 프리 갭 생기게 됩니다 합류까지 각 지정 된 지역에서 성장 하는 셀 수 있습니다. 보충 시험 화합물과 적절 한 세포 배양 접시에 다음 추가할 수 접시/잘. 나중에, 간격 폐쇄는 거꾸로 한 현미경, 이미지 수집에 대 한 비디오 카메라를 갖춘 선호 하나에서 다른 시간 간격 구상 될 수 있다. 마지막으로, 웹 기반 자동화 이미지 분석 프로그램에 의해 셀 적용 지역에 있는 변화의 측정 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도의 정량화를 허용할 것 이다. 전반적으로,이 방법은 고아 한 분석 결과, 스크래치를 무 균 바늘 confluent 셀 monolayers incising에 의해 수동으로 이루어집니다 또는 한 피 펫 팁11에 관하여 앞으로 단계입니다. 실제로, 마지막 절차 접시의 플라스틱 바닥을 파괴할 수 있는 플레이트/잘 하 고 주름을 만드는 표면 코팅. 또한, “상처” 지역은 없습니다, 간격의 전체 길이 따라 잘 정의 된 폭이 매우 바늘/팁에 연구원에 의해 적용 된 압력에 따라 달라 집니다. 또한, 빠질된 셀 스크래치;의 가장자리에서 생존 및 죽은 세포의 덩어리를 형성할 수 있다 또한, “상처” 영역으로 살아있는 세포의 확산 방해할 수 있습니다 세포 이동, 재현할 수 없는 결과12생성의 속도.
또한, 스크래치 이미지 분석 플랫폼 덕분에 사용자 빠르게 받을 수 (분) 이내 추가 소프트웨어를 습득의 필요성 없이 선택한 셀의 철새 행동에 양적 데이터. 이 플랫폼은 낮은 (~ 5 배)의 위상 대비 현미경 이미지, 중간 (~ 10 배), 및 높은 (~ 20 X) 확대 분석 가능 하다. Zip 파일 (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff 형식)에서 이미지의 업로드 후 분석 자동으로 실시 셀 적용 지역 및 스크래치 영역 비율 뿐만 아니라 셀의 속도 보여 주는 요약 파일을 생성 하려면 마이그레이션, 고유 시간 간격입니다.
개구리 피부 앰프-파생, 즉 Esc(1-21) 및 그것의 diastereomer Esc(1-21)-1 c13및 표현 기능 CF 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)14,15, 기관지 세포 라인을 사용 하 여이 작품에 치료 (제어) 샘플에 비해 펩타이드-유도 된 세포 이동의 예로 제공 됩니다. 기도 상피 세포 및 CFTR 폐 기능을 유지 하는 중요 한 역할을 재생 및 수리16상처. 또한, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), 상기 펩 티 드에 의해 유도 된 기관지 세포의 마이그레이션 EGFR12의 활성화를 포함 하는 증거의 선택적 억제제 (예, AG1478)17 에 의하여 18 보고 됩니다.
요약 하자면,이 절차의 목표는 어떻게 이러한 실리콘 문화 삽입 사용 정확 하 게 부착 세포 (예를 들어, 기관지 상피 세포)와 분자의 결정을 신속 하 고 쉽게 접근할 수 있는 분석 결과 나타냅니다 표시 이러한 이벤트를 제어 하는 메커니즘.
Protocol
Representative Results
Discussion
셀 마이그레이션 상처 치유, 배아 개발 및 암 전이 포함 하 여 많은 생리 적 및 병 적인 행사에 필수 과정입니다. 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 기본적인 절차는 포함 한다: (i) 세포 단층, (ii) 셀, confluent 계층에는 의사의 생산의 창조 (iii) 캡처 이미지 상처까지 여러 시간 간격의 폐쇄에 도달 그리고 (iv) 선택한 셀의 마이그레이션 속도 측정 하기 위해 이미지 시퀀스의 분석.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에서 역사적인 대학 로마와 이탈리아 낭 성 섬유 증 연구 재단 (프로젝트 보기 #11/2014 FFC 대표단 시에 나, 손 드리 오 Valchiavenna, Cerea Il 소리 디 제니와 파 비아에서 채택) 자금에 의해 지원 되었다. 이 작품의 일부 FILAS 그랜트 보호 FILAS RU 2014 1020에 의해 지원 되었다.
우리는 제공 하는 기관지 상피 세포에 대 한 박사로 레 타 포 레 라 (U.O.C. Genetica 메 디카, Istituto Giannina Gaslini, 제노바, 이탈리아)에 감사.
Materials
| Minimal essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
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