رواية في المختبر الجرح المقايسة الشفاء لتقييم الهجرة الخلية
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تأثير الببتيدات على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية. يسمح هذا الأسلوب للحصول على بيانات كمية عن سرعة الإغلاق الهجرة والجرح خلية السريع واستنساخه بدرجة عالية.
Abstract
والهدف من هذا العمل لإظهار طريقة جديدة لتقييم قدرة بعض الجزيئات إيمونومودولاتوري، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير)، حفز الهجرة الخلية. الأهم من ذلك الهجرة الخلية حدث الحد من معدل أثناء عملية التئام إعادة تأسيس سلامة ووظيفة طبيعية من طبقات الأنسجة بعد الإصابة. ميزة هذا الأسلوب على التحليل الكلاسيكي، الذي يستند إلى الصفر يدوياً صنع في أحادي الطبقة خلية، إدراج استخدام الثقافة السيليكون الخاصة توفير حجرات اثنين لإنشاء حقل تجرح شبه خالية من خلية مع عرض المعالم (500 ميكرومتر ). وبالإضافة إلى ذلك، من الممكن سبب منصة تحليل صورة الآلي، سرعة الحصول على البيانات الكمية على سرعة الهجرة خلية وإغلاق الجرح. أكثر دقة، سيظهر أثر اثنين جلد الضفدع الامبير على هجرة الخلايا الظهارية الشعب الهوائية. وعلاوة على ذلك، ستوفر المعالجة المسبقة لهذه الخلايا مع مثبطات محددة معلومات عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأحداث.
Introduction
ومن المعروف أنه إلى حد كبير أن التئام الجروح في الحيوانات عملية أساسية إعادة تأسيس سلامة ووظيفة طبيعية من طبقات الأنسجة بعد الإصابة1. وبالرغم من الأسطح الظهارية المعرضة للبيئة الخارجية (مثل الجلد، والجهاز التنفسي، والجهاز الهضمي المسالك) تشكل حاجزاً واقيا من الشتائم الفيزيائية والكيميائية، وتشكيل الجروح يمكن أن تحدث بسهولة، لا سيما بعد الجراحة أو العدوى الميكروبية2. على سبيل مثال، استعمار أنسجة الرئة بمسببات المرض البكتيري الانتهازية الزّنجاريّة Pseudomonas، خاصة في مرضى التليف الكيسي (CF)، يؤدي إلى الأضرار من ظهارة الخطوط الجوية مع ما يترتب عليه من فشل الجهاز التنفسي3، 4. التئام الجروح إليه إصلاح مضيف معقدة لاستعادة الهيكل العادي النسيج المصاب5. ويتميز بالتهاب الأولى، تليها فترة تجديد يشمل ابيثيلياليزيشن والأوعية والأنسجة يعيد البناء مع إنتاج الكولاجين والخلية التمايز6،7،8 . لضمان سلامة الظهارية والتحكم في انتشار الميكروبات، جميع الكائنات الحية تنتج جزيئات الدفاع، بما في ذلك مضادات الميكروبات الببتيدات (الامبير)9،10. الجرح الشفاء عملية من الصعب جداً لمحاكاة في المختبر بسبب الافتقار إلى الحطام الخلية والتفاعلات المعقدة بين أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك، في المختبر قدرة الببتيد لتسريع إغلاق الجرح الزائفة عن طريق حفز هجرة خلايا الظهارية يدل على قدرته على الشفاء من ظهارة الشبهة. وفي الواقع، الهجرة الخلية حدث الحد من معدل في التئام الجروح، ودراسة العوامل التي يمكن أن تؤثر الهجرة الخلية سيساعد على العلاجات المستهدفة لتحسين التئام الجروح.
هنا، يتم توفيرها تحليل تجريبي استنساخه بدرجة عالية استناداً إلى إدراج الثقافة السيليكون الخاص لتقييم الهجرة الخلايا في المختبر. ويستند على خلق فجوة ميكرومترات 500 (الجرح الزائفة) على أحادي الطبقة خلية المتلاقية. سوف تبدأ الخلايا عند حافة الحقل “الجرحى” الاصطناعي هاجروا إلى منطقة خالية من الخلية، وتشكيل خلية خلية اتصالات جديدة. ويمثل إدراج الثقافة أداة جديدة للجرح بسرعة شفاء التجارب. يتم توفير خزانان مفصولة بواسطة جدار 500 ميكرومتر، ويمكن وضعها بشكل صحيح في لوحة طبق 3 سم أو في بئر صفيحة 12-جيدا. ملء كل حجرة من الإدراج مع تعليق خلية يسمح للخلايا تنمو في كل مجال من المجالات المعينة حتى التقاء، بينما إزالة الإدراج سوف تولد فجوة نظيفة خالية من خلية من حوالي 500 ميكرومتر (بنفس عرض الجدار الفاصل). متوسطة ثقافة خلية الصحيحة وتستكمل مع مجمع لاختبار يمكن إضافتها فيما بعد إلى الطبق لوحة/جيدا. وبعد ذلك يمكن تصور إغلاق الفجوة في فترات زمنية مختلفة تحت مجهر مقلوب، يفضل واحدة مزودة بكاميرا فيديو للحصول على الصور. وأخيراً، سيسمح قياس التغيرات في المنطقة المغطاة بالخلية ببرنامج تحليل الصورة التلقائية المستندة إلى ويب التحديد الكمي لسرعة الهجرة خلية وإغلاق الجرح. وعموما، هذا الأسلوب خطوة إلى الأمام فيما يتعلق بالتحليل الكلاسيكية، حيث الصفر يدوياً بواسطة إينسيسينج مونولاييرس خلية المتلاقية مع إبرة معقمة أو ماصة نصيحة11. وفي الواقع، يمكن أن تدمر الإجراء الأخير أسفل الطبق البلاستيك لوحة/جيدا وطلاء السطح، خلق التجاعيد. وبالإضافة إلى ذلك، منطقة “الجرحى” لا يكون عرض المعالم على طول الفجوة، كهذا يعتمد إلى حد كبير على الضغوط التي مورست من الباحثين بالإبرة/التلميح. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تشكل الخلايا المزاحة كتل من الخلايا الحية والميتة في حواف الصفر؛ وعلاوة على ذلك، انتشار الخلايا الحية في منطقة “الجرحى” يمكن أن تتداخل مع سرعة الهجرة الخلية، وتوليد نتائج غير قابل لإعادة الإنتاج12.
وبالإضافة إلى ذلك، وبفضل منصة تحليل صورة الصفر، يمكن للمستخدمين سرعة استلام (خلال دقائق) البيانات الكمية بشأن سلوك المهاجرة من الخلايا المحددة دون الحاجة إلى الحصول على برامج إضافية. هذا البرنامج قادر على تحليل التباين مرحلة الفحص المجهري الصور منخفض (~ 5 س)، والمتوسطة (~ 10 X)، والتكبير عالية (~ 20 X). بعد تحميل ملف مضغوط للصور (في *.jpg، *.jpeg، *.jp2، *.png، *.gif، تنسيق *.tiff) يجري التحليل تلقائياً لإنشاء ملف ملخص يبين النسبة المئوية للمناطق المغطاة بالخلية ومناطق الاحتكاك، وكذلك سرعة الخلية الهجرة، في فترات زمنية مختلفة.
في هذا العمل، باستخدام جلد الضفدع أمبير-مشتق، أي Esc(1-21) وفي دياستيريومير Esc(1-21)-1 ج13، وخط خلية الشعب الهوائية معربا عن وظيفية التليف الكيسي transmembrane الموصلية منظم (CFTR)14،15، ويرد مثال للهجرة الخلية الببتيد المستحثة بالمقارنة مع عينات غير المعالجة (التحكم). ملاحظة أن ظهارة مجرى الهواء و CFTR تلعب دوراً حاسما في الحفاظ على وظائف الرئة والجرح إصلاح16. وعلاوة على ذلك، عن طريق مثبطات انتقائية (مثلاً، AG1478)17 من مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، دليل على أن هجرة خلايا الشعب الهوائية الناجمة عن الببتيدات المشار إليها أعلاه ينطوي على تفعيل EGFR12، ويقال 18 .
وخلاصة القول، أن الهدف من هذا الإجراء لإظهار كيفية الاستخدام من هذا القبيل إدراج الثقافة سيليكون يمثل مقايسة سريعة ويمكن الوصول إليها بسهولة لدقة تحديد الهجرة ملتصقة الخلايا (مثل الخلايا الظهارية الشعب الهوائية) والجزيئية آليات التحكم في مثل هذه الأحداث.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهجرة الخلية عملية أساسية في العديد من الأحداث الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك التئام الجروح، التطور الجنيني، وسرطان خبيث. ويشمل الإجراء الأساسي لدراسة الخلية الهجرة في المختبر : (ط) إنشاء خلية أحادي الطبقة، (ثانيا) إنتاج الجرح الزائفة في الطبقة المتلاقية للخلايا، يتم التوصل إلى ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من مؤسسة البحوث التليف الكيسي الإيطالية (مشروع تقصي الحقائق والتوفيق #11/2014 اعتمدته “الوفود تقصي الحقائق والتوفيق” من سيينا، فالتشيافينا سوندريو، سيارا إيل Sorriso دي جيني وبافيا) وجامعة سابينزا في روما. كما أيد جزءا من هذا العمل قبل فيلاس منحة سلطته فيلاس-رو-2014-1020.
ونحن ممتنون للدكتور لوريتا فيريرا (تم U.O.C. Medica، معهد جيانينا جاسليني، جنوا، إيطاليا) لتوفير الخلايا الظهارية الشعب الهوائية.
Materials
| Minimal essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections – are we threatened by multi-resistant pathogens?. Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?. PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
