Экспериментальный протокол для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах, подвергшихся воздействию органохлорных пестицидов

Влияние органохлорных пестицидов (OCPs) на здоровье, например, репродуктивное вмешательство, иммунологическая токсичность, метаболические изменения были^{ранее изучены 1,,2,,3}. Методы обнаружения клеточного метаболизма и выявления митохондриальной дисфункции позволили ученым понять роль митохондриальной функции^,,,(т.е.митохондриальных уровней STAT3,^{лактата, пирувата, соотношения лактата к пирувату,}коэнзима No10, митохондриальной утечки протонов, биоэнергетики, биогенеза и^{динамики) втаких}областях, как старение, ожирение, диабет, сердечно-сосудистая функция, рак и токсичность.⁶ В этом документе мы описываем методы оценки митохондриальной дисфункции, вызванной OCPs.

Мы подвергли клетки HepG2 воздействию гексахлороциклогексана (З-ГХГ), одного репрезентативного OCP, на 24 ч в дозе, эквивалентной внутреннему воздействию человека. Во-первых, TEM был применен для наблюдения за ультраструктурой гепатоцитов, таких как ядра, митохондрии и эндоплазмический^{ритикулум 8}. По сравнению с обычными микроскопами, TEM позволяет исследовать 2D и 3D ультра-структуру клеток и клеточных компонентов (клеточные линии или ткани), морфологию, химический состав, а также функции природных или искусственных материалов, которые играют ключевую роль в современной науке и технике. Митохондриальная функция была дополнительно оценена по интенсивности митохондриальной флуоресценции, уровням аденозина 5′-трифосфата (АТФ), скорости потребления кислорода (OCR) и митохондриальному мембранальному потенциалу (MMP) в клетках HepG2, инкубированных С-ГХГ. Мито-трекер зеленый митохондрии зеленый флуоресцентный зонд, который может быть использован для живых клеток митохондриальных флуоресцентных окрашивания. Митохондрии в гепатоцитах были окрашены мито-трекер зеленый раствор и митохондриальной интенсивности флуоресценции, количество и картина наблюдались с конфокальной^{микроскопии 9}. Митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд может быть использован для окрашивания живых клеток. По сравнению с роданом 123 или JC-1 митохондриальный зеленый флуоресцентный зонд не зависит от митохондриального мембранного потенциала митохондриального окрашивания. Уровни АТФ определялись набором люциферазы-люциферина и нормализовались концентрацией белка. Набор анализа АТФ может быть использован для обнаружения уровней АТФ в общих растворах, клетках или тканях. Этот комплект основан на светлячка люцифераза катализа флуоресценции для создания флуоресценции, когда АТФ требуется для обеспечения энергией. Когда светлячок люцифераза и флуорессейн являются чрезмерными, в определенном диапазоне концентрации, генерация флуоресценции пропорциональна концентрации АТФ. Кроме того, этот комплект был специально разработан для оптимизации химилюминесценции АТФ. АТФ, как наиболее важные молекулы энергии, играет важную роль в различных физиологических или патологических процессах клеток. Изменения в уровнях АТФ могут отражать дефекты в функции клеток, особенно митохондриальной выработки энергии. Обычно при апоптозе, некрозе или в каком-то токсичном состоянии уровень клеточного АТФ ^{снижается на 10.} MMPs анализ комплект с JC-1 является комплект, который использует JC-1 в качестве флуоресцентного зонда для обнаружения клеток, тканей или очищенных MMPs быстро и чувствительно. Он может быть использован для раннего выявления апоптоза. Катионый краситель JC-1 является флуоресцентным зондом, используемым для обнаружения MMP, который может быть проанализирован под цитометрией потока, указанной изменениями зеленого и красного соотношения флуоресценции. Когда MMP высок, JC-1 агрегируется в матрице митохондрий, чтобы сформировать полимер (J-агрегаты), который производит красную флуоресценцию. Когда MMP низок, JC-1 не может накапливаться, и образует мономер, который производит зеленую флуоресценцию^11. Таким образом, соотношение красной и зеленой флуоресценции может отражать уровень MMP. OCR клеток является важнейшим показателем нормальной клеточной функции¹². Он рассматривается как параметр исследования митохондриальной функции. Комплект стресс-теста Cell mito обеспечивает стабильный метод анализа ключевых параметров митохондриальной функции. Комплект обеспечивает контроль качества и прогностические реагенты, а также стандартный метод для выполнения клеточного митохондриального стресс-теста. Он может быть использован для обнаружения всех типов клеток, в том числе первичных клеток, клеточных линий, подвесных клеток, а также для островков, нематод, дрожжей и изолированных митохондрий.

Измерение OCR может обеспечить ценное понимание физиологического состояния или изменения клеток. Он был определен с помощью внеклеточного анализатора потока для обнаружения дыхания базовых, протонной утечки, максимальных дыхательных путей, оборота АТФ и резервной мощности. Короче говоря, после базовых измерений OCR, OCR был обнаружен после последовательного добавления к олигомицину (ATP Coupler), FCCP (митохондриальное окислительное фосфорилирование uncoupler) и антимицин а/ротенон (ингибитор потребления кислорода) на колодец.

В целях содействия разработке более конкретного протокола для обнаружения митохондриальной функции в гепатоцитах in vitro, мы представляем здесь эксперименты TEM, конфокальной микроскопии, люминометра, цитометра потока и внеклеточного анализатора потока с будущим применением в изучении митохондрий повреждения, связанные с неблагоприятными исходами.