Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking
Summary
In dit protocol beschrijven we een techniek om te ontdekken Zika virus specifieke diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray. Dit protocol kan readly worden aangepast voor andere opkomende infectieziekten.
Abstract
High-density peptide microarrays toestaan screening van meer dan zesduizend peptiden op een uniforme standaard microscopie dia. Deze methode kan worden toegepast voor drugontdekking therapeutische target identificatie en ontwikkeling van diagnostiek. Hier presenteren we een protocol om te ontdekken van specifieke Zika virus (ZIKV) diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray. Een menselijke serummonster gevalideerd voor ZIKV infectie was geïncubeerd met een hoge dichtheid peptide microarray die hele ZIKV eiwit vertaald in 3,423 unieke 15 lineaire aminozuurresidu (aa) ‘s met een overlapping van 14-aa residuen bevatten afgedrukt in tweevoud. Kleuring met verschillende secundaire antilichamen binnen dezelfde array, we gedetecteerd peptiden die zich aan immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG) antilichamen in het serum aanwezig binden. Deze peptiden werden geselecteerd voor verdere validatie experimenten. In dit protocol beschrijven we de strategie gevolgd om te ontwerpen, verwerken en analyseren van een high-density peptide microarray.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnose op basis van klinische symptomen is uitdagend omdat het deelt vectoren, geografische spreiding en symptomen met Dengue en Chikungunya virus infectie1. Gezien het risico voor ongewenste zwangerschap resultaten bij vrouwen geïnfecteerd met ZIKV tijdens de zwangerschap, is het belangrijk om te onderscheiden tussen de 3 virussen. Hoewel de huidige moleculaire diagnostische tests specifiek zijn, zijn ze alleen nuttig in bloed of speeksel in de relatief korte periode van acute infectie2,3. Serologische tests zijn essentieel voor de diagnose buiten deze beginperiode van infectie4.
De ontwikkeling van een specifieke serologische test ZIKV is een uitdaging om twee redenen: ten eerste de Zika-antigenen die het menselijke immuunsysteem reageert op niet op dit moment bekend zijn; en tweede, geconserveerde flavivirussen aminozuur sequenties veroorzaken antilichaam Kruisallergie. Ons doel was om te ontdekken unieke ZIKV specifieke peptiden in diagnostiek worden gebruikt. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om scherm peptide bibliotheken die betrekking hebben op hele eiwitten met inbegrip van phage, bacteriële, en gist oppervlak weer5,6,7,8,9, 10. Onze strategie was het gebruik van een hoge dichtheid peptide microarray waarmee snelle en goedkope high-throughput serologische screenings11,12 en nadien de geïdentificeerde peptiden kunnen worden gebruikt ter verbetering van de huidige serologische tests voor de opsporing van ZIKV infectie.
Dit protocol maakt de ontdekking van Zika virus specifieke diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray (Figuur 1). De high-density peptide microarray werd geproduceerd met behulp van de peptide laser printing technologie. De gehele ZIKV eiwit reeks bestaande uit 3,423 aminozuurresidu’s op basis van de Frans Polynesische stam (GenBank: KJ776791.2), werd gedrukt op een standaard glasplaatje in blokken van 15 lineaire residuen met een overlapping van 14 aminozuurresidu’s in tweevoud voor een totaal 6,846 peptide vlekken. Naast de gehele Zika eiwit sequentie peptides, de microarray maakt gebruik van Influenza hemagglutinine (HA) peptiden voor interne controle.
Een Zika gevalideerd positieve serummonster verkregen Wadsworth Center (Albany, NY), werd gebruikt voor het identificeren van specifieke immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG) reactieve peptiden. Na incubatie met het monster ‘s nachts, was de microarray gekleurd met een secundaire fluorescerende geconjugeerd antilichaam (Anti-menselijke IgM of anti-menselijke IgG) en geanalyseerd op een microarray scanner. Kwantificering van plek intensiteiten en peptide aantekening werd uitgevoerd met een specifieke software geboden door hetzelfde bedrijf dat de microarray vervaardigd.
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwierpen een protocol met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray met de gehele Zika virus eiwit sequentie (Frans-Polynesische stam). De microarray werd geproduceerd door afdrukken 3,423 verschillende overlappende lineaire peptiden. Elke peptide was 15 aminozuren en gevarieerd door slechts één residu van zijn naaste buur in de reeks (d.w.z., 14 residu overlapping). Hoewel kortere overlappingen kunnen worden afgedrukt, is epitoop toewijzing nauwkeuriger met langere overlappingen. Elke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Huidige wordt ondersteund door een SBIR (Small Business Innovation Research) administratieve toeslag subsidie van NIDCRR44 DE024456. U01 DE017855 NIDCR HIV-subsidie die ontstaan uit NIDCR verlenen voor de ontwikkeling van een bevestigende diagnose van de point-of-care voor HIV. Wij erkennen dankbaar Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) voor haar technische bijstand en vriendelijke ondersteuning. Wij danken ook NYU Langone Medical Center voor het LI-COR Odyssey Imaging systeem.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue’s cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
- Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the “Immunosignaturing Effect”. Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
