סינתזה של Functionalized 10-nm פולימר מצופה זהב חלקיקים אנדותל הכוונת משלוח סמים

1. הכנה או רכישה של מניות פתרונות (לאחסן בטמפרטורת החדר או קפוא עד לשימוש) הכן פתרון 1 מ’ מניות הידרוקסיד הנתרן (NaOH) על ידי המסת 400 מ”ג NaOH 10 מ”ל מים הנדסה גנטית בטמפרטורת החדר ולאחר ערבוב החומרים היטב.הערה: הנדסה גנטית מים מוגדר מים ללא זיהומים כגון חלקיקים, חיידקים, nucleases, יונים או עקבות של אורגניקס. מערכת טיהור משמש כדי להשיג את המים הנדסה גנטית, וכתוצאה מכך שלה resistivity של mΩ·cm עד 18.2, המציין זיהום anionic נמוכה. לא מומלץ השימוש זמינים מסחרית בקבוקי מים הנדסה גנטית. מעתה ואילך, את המים הנדסה גנטית יכונו כמו מים, אלא אם צוין אחרת. להכין פתרון מניות של NaOH M על ידי המסת 2.4 g של NaOH ב- 10 מ”ל של מים, ולאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. להכין פתרון מניות 250 מ מ של חומצה chloroauric (HAuCl4) על ידי המסת 1g של HAuCl מיובשים4 ב- 10.16 מ ל מים. למהול 1 מ”ל של 250 מ מ HAuCl4 עם 9 מ ל מים כדי להשיג ריכוז בעבודה של 25 מ מ HAuCl4. אחסן את הפתרון4 HAuCl בטמפרטורת החדר. הכן בופר קרבונט 0.1 M ב- pH 8.8, על ידי המסת 84 מ ג נתרן ביקרבונט במים 10 מ”ל והתאמה של ה-pH ל 8.8 על-ידי הוספת 6 M NaOH מ שלב 1.2. אחסן את המאגר קרבונט בטמפרטורת החדר. מערבבים את 20 מ של tetrazolium מורכבים, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium מלח (MTS), עם סוכן המייצבת, phenazine ethosulfate (פסי) (ראה טבלה של חומרים). אחסן את התערובת MTS/PES ב- aliquots (לכל היותר 10 מחזורים ההקפאה-הפשרה) ב-20 ° C בחושך. 2. סינתזה של הליבות זהב ננו-חלקיק להכין בתמיסה מדוללת של THPC על-ידי הוספת µL 12 של 80% THPC במים עד 1 מ”ל של מים בצינור microcentrifuge בטמפרטורת החדר. לאבטח בקבוקון התחתון עגול 100-mL במהלך במרכז צלחת מערבבים מגנטי. שופכים 45 מ של מים לתוך הבקבוק ומערבבים במים במהירות של 300 סל ד באמצעות בר קטן בצורת ביצה מערבבים מגנטי. להוסיף 0.5 מ”ל של 1 M NaOH ו- 1 מ”ל של פתרון THPC מדולל. להמשיך לבחוש את התערובת התגובה נמרצות במשך 5 דקות. ממשיכים לערבב את התערובת ולהוסיף 2 מ של 25 מ מ HAuCl4 פתרון. הצבע של התערובת ישתנה מצהוב עד חום כהה בתוך שניות, המציין שהיווצרות THPC הכתיר AuNPs עם מטען שלילי. מערבבים את התערובת למשך 15 דקות נוספות לאפשר היווצרות מלאה של הליבות זהב. 3. תוספת של פולימר בקורונה סביב חלקיקי זהב במהלך תקופת 15 דקות שמתואר בשלב 2.3, להכין יתד פתרונות על ידי המסת כל אחד מאלה במים 1 מ”ל ב- 4 mL מבחנות זכוכית: 30 מ”ג NH2-פג-SH; 7.5 מ”ג, m-פג-SH; 7.5 מ”ג COOH-פג-SH.הערה: הריכוזים שנוצר צריך להיות 8.8 M NH2-פג-SH, 3.75 מ’ מ’-פג-SH ולאחר 3.75 מ’ COOH-פג-SH. לאחר הפחתת מהירות מלהיב הפתרון ב. הבקבוק העגול התחתון כדי 100 סל”ד, הוסף שהפתרונות פג הפתרון של THPC הכתיר AuNPs dropwise. להמשיך לבחוש את התערובת בעדינות בין לילה, בטמפרטורת החדר, כדי להבטיח הסרה יעילה של THPC והחלפה מאת פג. 72 ה הבא לשימוש 12-14 kDa משקל מולקולרי תאית הקיצוץ קרום כדי dialyze את התערובת מנוער נגד דלי 4 ליטרים של מים מנוער-60 סל ד. לקשור את הקצוות של הממברנות על-ידי דיאליזה קליפים ולהעביר את הפתרון באמצעות פיפטה.הערה: תהליך הדיאליזה זה עם קרום הקיצוץ kDa 12-14 רק מסיר פג unreacted THPC, אחרים כימית ריאגנטים, על ידי דיפוזיה לאורך מעבר הצבע ריכוז. כדי לשמור על הצבע ריכוז גבוה ולקדם דיפוזיה רציפה, להחליף את המים כל 2 h עבור ה 6 הראשון וכל 6-12 h עבור ה 66 הנותרים.הערה: המטרה של לוח זמנים זה שינוי מים היא להכיל פעפוע מהיר המתרחשת בהתחלה בגלל הריכוז הגבוה בתחילה בתוך המדגם. תהליך הדיאליזה שתוארו לעיל עלים הפתרון nanoparticle למחצה מטוהרים, כי חלקיקים, פוחת משקעים, אגרגטים, זיהומים גודל גדול אחרים אינם יכולים לעבור דרך הנקבוביות של 12-14 kDa הקיצוץ קרום. לסנן את הפתרון nanoparticle למחצה מטוהרים לתוך צינור חרוטי 50-mL באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm כדי להסיר את פוחת משקעים הנותרים, אגרגטים זיהומים גדולות אחרות. למקם את צינור חרוטי במקפיא-80 ° C ולאפשר את הפתרון PEGylated AuNP (פג-AuNP) מטוהרים ומקפיאים כ 5 שעות. השתמש הקפאה מייבש כדי lyophilize את פג-AuNP מטוהרים. לאחסן את יבש, מטוהרים פג-AuNP ב 4 ° C עד השימוש. 4. conjugating Fluorophores באמצעות N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר אל NH2 הקבוצות על פג-AuNP לאבטח בקבוקון תחתית עגולה 50-mL במהלך במרכז צלחת מערבבים מגנטי. למלא את הבקבוק עם 18 מיליליטר מים ומערבבים את המים ב 100 סל”ד באמצעות בר בצורת ביצה מערבבים מגנטי. שוקל 2 מ ג של פג-AuNP lyophilized צינור חרוטי 4 מ”ל, באמצעות סרגל benchtop ברמת דיוק גבוהה. להשתמש באקדח אנטי סטטי לחסל הסטטי והצמדות של האבקה פג-AuNP אל פני השטח צינור. להוסיף 2 מיליליטר מים ברכבת התחתית. שופכים 2 mL פג-AuNP פתרון לתוך הבקבוק העגול התחתון בשביל שיחזור נוסף בסכום של 20 מ ל מים. להמשיך לבחוש את התערובת על 100 סל”ד באמצעות בר בצורת ביצה מערבבים מגנטי. להוסיף 1 מ”ל של 0.1 M, pH 8.8 קרבונט מאגר 20 מ של AuNP משוקם הכלול הבקבוק העגול התחתון. המשך ערבוב. להוסיף 5 µL של 10 מ”ג/מ”ל פלורסנט NHS אסתר דימתיל סולפוקסיד.הערה: ניתן להשתמש בכל הפלורסנט בתהליך זה. מערבבים את פג פלורסנט בן לילה. שיהיה בטמפרטורת החדר ומכוסים בנייר כסף. 72 ה הבאה להסיר עודפי fluorophores באמצעות פרוטוקול שמתואר בשלב 3.3. בקצרה, dialyze את התערובת מנוער באמצעות דלי 4 ליטרים של מים, 12-14 kDa משקל מולקולרי תאית הקיצוץ קרום. להחליף את המים כל 2 h ל-6 הראשון h וכל 6-12 h עבור ה 66 הנותרים. להשיג 1 מ”ל של מטוהרים פלורסנט פג-AuNP הפתרון, שישמש עבור אפיון המתוארות להלן בסעיף 5. הקפאה של lyophilize הפתרון הנותרים כדי להשיג פלורסנט חלקיקים בצורת אבקת לאחסון ב 4 ° C, כמתואר בצעדים 3.5-3.7. השתמש במסנן מזרק 0.2 µm לחטא ולהסיר כל פוחת משקעים פוטנציאליים פעם מחדש עבור יישומים התרבות תאים. 5. אפיון של חלקיקי זהב PEGylated פלורסנט שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) כדי להמחיש את ליבת nanoparticle זהב ולכמת את הגדלים ירידה µL 10 של הפתרון פג-AuNP פלורסנט מטוהרת על גבי רשת TEM פחמן מצופה רשת. לאחר 5 דקות, להשתמש פיסת נייר סינון כדי בקפידה לפתיל משם עודפי נוזלים מן הקצה של הרשת TEM עד סרט המכיל את פלורסנט שפג-AuNPs נשאר מאחור. הצג את פג-AuNPs פלורסנט 80 kV, בהגדלה גדולה של 50,000-150, 000. צלם תמונות דיגיטליות.הערה: רק את הליבה זהב יהיה גלוי כי המקל אינה צפופה על TEM אלקטרון. באמצעות תוכנת מדידה, לקבוע קנה המידה מתאם לבר בקנה מידה. לחשב על הקוטר של ליבות זהב כ-20 ולאחר מכן לקבוע את קוטר ממוצע הליבה זהב.הערה: מערכת ההדמייה TEM באופן אוטומטי ממקם בר בקנה מידה תמונות דיגיטליות. מדידה של גודל ננו-חלקיק hydrodynamic באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS) העברת 1 מ ג של AuNPs מצופים THPC lyophilized לתוך צינור microcentrifuge באמצעות גישה שמתואר בשלב 4.2. העברת 1 מ ג של lyophilized פג-AuNP בשפופרת נפרדים. להוסיף 1 מ”ל של מים כל שפופרת ולהעביר כל פתרון AuNP 1 מ”ל פלסטיק שקוף. למקם את cuvette מכשיר DLS ומדידת כדורית קטרים hydrodynamic באמצעות תוכנה מנתח חלקיק זה מובנה בתוך המערכת DLS. העלילה על הקוטר hydrodynamic נמדד באמצעות תבנית היסטוגרמה.הערה: ההיסטוגרמה יקבץ חלקיקים לפי גודל. הקבוצה הגדולה ביותר של חלקיקים נבאר את הקוטר המתארת בצורה הטובה ביותר לגודל AuNPs מסונתז פרוטוקול זה. אישור fluorometric קרינה פלואורסצנטיתהערה: המדגם אותו ואת cuvette מהשלב 5.2 יכול לשמש כדי למדוד את האות פלורסנט. להסיר את cuvette DLS והכנס לתוך מצלמות-דיגיטליות. קבע אורך הגל של עירור 633 ננומטר, לקריאה ידי קרינה פלואורסצנטית הנפלט אותות לאורך טווח אורך הגל של 650-800 ננומטר. מאשרים כי השיא הוא כ 665 ננומטר, לאפקטים הפסגה פליטה עבור NHS.הערה: להתאים את אורכי הגל עירור, פליטה לפי fluorophore המשמשים בתהליך. MTS assay11 כדי להעריך את הביו בתרבות התחתון 96-ובכן ברור סטרילי רקמות טיפול צלחת, פיפטה µL 100 ששינה הנשר של Dulbecco בינוני (DMEM; בתוספת 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ו- 3.2 x 103 תאים בכל טוב.הערה: במחקר זה, תאי אנדותל fat pad עכברים משמשים. סך של 21 הבארות משמשים כדי לאפשר משכפל 3 עבור כל אחד הריכוזים nanoparticle שונים 7 (ראה שלב 5.4.3 ריכוזי עניין ספציפי). מאפשרים לתאים לגדול confluency ב לחות ו-5% CO2 נשלט חממות ב 37 ° C11. . הכן טורפדו microcentrifuge נפרדים, שכל אחד מהם מכיל 300 µL של DMEM עם חלקיקים של ריכוזים שונים. מחקר זה דורש 7 צינורות שונים של DMEM עם ריכוז פג-AuNP הבאים: 0 µg/mL 10 µg/mL, µg 50/mL, µg 100/mL, µg 250/mL, 500 µg/mL, 1,000 µg/mL. מחוק לגמרי את DMEM באמצעות הרכבת התחתית. למלא את בארות שהפקידים 100 µL של התקשורת DMEM המכיל 0, 10, 50, 100, 250, 500 או 1000 µg/mL של AuNP. לאפשר את התאים ואת חלקיקים כדי שיתוף תקופת דגירה של אורך זמן, אני פה בשביל 16 h שנקבע מראש. לקראת סוף תקופת הדגירה, להפשיר את התערובת MTS/PES מהשלב 1.5. לאחר דגירה, וארוקן את DMEM, על תנאי, מצורף באופן רופף חלקיקים מן הבארות. להוסיף 100 µL של DMEM טריים יחד עם 20 µL של MTS/PES פתרון כדי לקבל 1:5 MTS/PES ליחס DMEM לפי הפרוטוקול של היצרן. דגירה התאים עם MTS/PES ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.הערה: זה זמן הדגירה 2 h נקבעת על-ידי פעילות חילוף החומרים של תאי אנדותל, ניתן להגדיל עד עד 4 שעות עבור סוגי תאים אחרים. בתוך תקופת 2 h, MTS עובר מטבוליזם על ידי תאי אנדותל לתוך צבעוניים formazan זה מתערבב עם DMEM. התאימות של פג-AuNP ועל הסבירות תא הכדאיות תודגמנה עם formazan יותר צבעוניים. רעילות של פג-AuNP, את הסיכוי כי התאים מתים יוצגו בצבע פחות אינטנסיבי. לבצע ניתוח ערכי צבע מוחלטים של כל טוב על-ידי קריאת ספיגת-492 nm בקורא צלחת תואמת. עבור כל ריכוז ננו-חלקיק, לחשב את ספיגת הממוצע של ספיגת triplicate ערכים. לחלק את ספיגת ממוצע לפי הערך המתקבל ממוצע של ספיגת בבארות המכיל חלקיקים µg/mL 0.הערה: הבארות הללו מכילים AuNPs אין לשמש פקדי חישוב אחוז הכדאיות תא בתגובה nanoparticle טיפול מנוהל בבארות אחרים. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית הערכה של ספיגת ננו-חלקיק בתאי האנדותל חסיד עם glycocalyx תקין או לקוי11 זרע 1.0 x 104 תאים/cm2 עכברוש שמן פאד תאי אנדותל על coverslips זכוכית סטריליים 12 מ”מ דקה ולהאכיל תאים עם DMEM בתוספת 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. מאפשרים לתאים לגדול confluency מלא לחות ו CO2 נשלט חממות ב 37 מעלות צלזיוס, במשך כ- 3 ימים. להוסיף טיפולים כדי לשנות את glycocalyx, אם הדבר ישים. לדוגמה, טיפול h 2 תאי אנדותל תרבותי עם 2.5 x 10-6 IU heparinase השלישי אנזים מבזה את glycocalyx באמצעות רכיב סולפט שלה הפאראן בבועיות במיוחד.הערה: שניתן למדל glycocalyx בריא על ידי גידול תאי אנדותל כפי שמתואר בשלב 5.5.1 ללא התוספת של אנזימים השפלה. עם glycocalyx אנדותל נותר שלם או עיבוד לקוי, דגירה תאי אנדותל עם פלורסנט AuNPs µg 550/mL עבור 16 h או אחרים הזמן הרצויים. לשטוף בעדינות את התאים עם 2 מ של 37 ° C 1% שור אלבומין בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS; המכיל 100 מ ג/ליטר סידן ומגנזיום 100 mg/L). להטביע התאים 2 מ של paraformaldehyde 2% ו- 0.1% גלוטראלדהיד ב- PBS, ולאפשר את התאים לתקן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את הפתרון תיקון אלדהיד ולשטוף את התאים עם טמפרטורת החדר PBS שלושה מחזורים 5-מין. לפני יישום נוגדן ראשוני, לחשוף תאי אנדותל כדי סרום עז 2% ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים. תאים חייב להיות מכוסה לגמרי לפי הפתרון חסימה. דגירה תאי אנדותל בין לילה עם 1% אנטי-הפאראן גופרתי העיקרי נוגדנים בסרום עז 2% ב- PBS ב 4 ° C כדי להדביק תווית הרכיב הפאראן גופרתי glycocalyx. ודא התאים קבוע מלא בקשר עם הפתרון נוגדן. למחרת, לשטוף הנוגדן עם טמפרטורת החדר PBS שלושה מחזורים 10 דקות. דגירה תאי אנדותל עם 1:1,000 דילול של הנוגדן המתאים משני פלורסנט למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כהה או מכוסה ברדיד אלומיניום. לשטוף את הנוגדן משני עם טמפרטורת החדר PBS שלושה מחזורים 10 דקות. לטעון את coverslip על גבי שקופיות מיקרוסקופ באמצעות של אנטי-עמעום הרכבה בינונית המכיל 4′, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (דאפי) עבור גרעינים מכתים. לאטום את הקצוות של coverslip באמצעות לק. התמונה תא אנדותל immunostained פלורסנט דוגם עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, באמצעות ערוצי כחול, ירוק ואדום רחוק כדי להמחיש את הגרעינים הפאראן גופרתי glycocalyx, חלקיקים, בהתאמה.