기능성된 10 nm 폴리머-코팅 된 금 입자 피 대상에 대 한 및 약물 전달의 합성

1. 준비 또는 재고 솔루션의 조달 (실내 온도에 저장 또는 사용까지 냉동) 400 mg, 실내 온도에 10 mL 초순에 NaOH를 용 해 하 고 잘 재료를 혼합 하 여 1 M 수산화 나트륨 (NaOH) 재고 솔루션을 준비 합니다.참고: 초순 수 입자, 박테리아, nucleases, 이온, 생명체의 흔적 등 불순물 없이 물으로 정의 됩니다. 정화 시스템 초순, 최대 18.2 ㏁, 낮은 음이온 오염을 나타내는의 저항력에 결과 얻을 하는 데 사용 됩니다. 상업적으로 이용 가능한 생된 초순 수의 사용을 권장 하지 않습니다. 이제부터,이 초순 것입니다 라고 하 물, 별도로 지정 하지 않는 한. 물 10 mL에 NaOH의 2.4 g을 용 해 하 여 6 M NaOH 재고 솔루션을 준비 하 고 실 온에서 솔루션을 저장할. 10.16 mL의 물에 말린된 HAuCl4 의 1 g을 용 해 하 여 chloroauric 산 (HAuCl4)의 250 m m 재고 솔루션을 준비 합니다. 250 mm HAuCl4 25 mM HAuCl4의 작업 농도를 9 mL 물 1 mL를 희석. 실 온에서 HAuCl4 솔루션을 저장 합니다. 물 10 mL에에서 84 mg 나트륨 중 탄산염 용 해 단계 1.2에서에서 6 M NaOH 추가 하 여 8.8에 pH를 조정 하 여 pH 8.8에서 0.1 M 탄산 버퍼를 준비 합니다. 실 온에서 탄산 버퍼를 저장 합니다. 20 mL tetrazolium의 안정화 에이전트, phenazine ethosulfate (PES) 화합물, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium 소금 (MTS), 믹스 ( 재료의 표참조). 어둠 속에서-20 ° c (최대 10 freeze-thaw 주기)에 대 한 aliquots에서 MTS/PES 혼합물을 저장 합니다. 2입니다. 금 나노 코어의 합성 80%의 12 µ L을 추가 하 여 희석된 THPC 솔루션 준비 물 실 온에서 microcentrifuge 튜브에서 물 1 mL에 THPC. 자기 저 접시의 센터를 통해 100 mL 둥근 바닥 플라스 크를 보호 합니다. 플라스 크에 물 45 mL를 붓고 하 고 작은 달걀 모양의 자석 저 어 막대를 사용 하 여 300 rpm에서 물을 저 어. 0.5 mL의 1 M NaOH와 희석된 THPC 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 계속 5 분 동안 적극적으로 반응 혼합물을 저 어. 혼합 교 반 계속 하 고 25 mM HAuCl4 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 혼합물의 색 초 이내에, THPC의 대형 덮인 AuNPs 네거티브 차지 나타내는 어두운 갈색 노란색에서 변경 됩니다. 골드 코어의 완전 한 형성에 대 한 수 있도록 추가 15 분을 위한 혼합물을 저 어. 3. 금 나노 입자 주위 폴리머 코로나의 추가 2.3 단계에 설명 된 15 분 기간 동안 준비 못 솔루션 4 mL 유리 튜브에 1 mL 물에 다음의 각각을 용 해 하 여: 30 mg NH2-말뚝-쉬; 7.5 mg m-못-쉬; 7.5 밀리 그램 COOH 못 쉬입니다.참고: 결과 농도 8.8 M NH2이어야 한다-말뚝-SH, 3.75 M m-못-SH, 그리고 3.75 M COOH-말뚝-SH. 100 rpm을 둥근 바닥 플라스 크에 솔루션의 교 반 속도 줄여, THPC의 솔루션을 페그 솔루션 출장 AuNPs dropwise 추가 합니다. 계속 THPC의 효율적인 제거 및 말뚝에 의해 대체 되도록 실 온에서 부드럽게 하룻밤, 혼합물을 저 어. 다음 72 h에 대 한 12-14 kDa 분자량 컷오프 셀 루 로스 멤브레인을 사용 하 여 60 rpm을 내면서 물의 4 L 물통에 대 한 흔들된 혼합물을 dialyze. 투 석 클립에 의해 세포 막의 끝 고 피 펫을 통해 솔루션을 전송.참고: 12-14 kDa 차단 막으로 투 석 과정이만 제거 됩니다 unreacted 말뚝, THPC, 및 다른 화학 반응 물 농도 기온 변화도 따라서 유포에 의해. 높은 농도 기온 변화도 유지 하 고 지속적인 보급 촉진, 물 매 2 첫 번째 6 h h 고 나머지 66 h에 대 한 모든 6-12 h을 변경 합니다.참고:이 물 변경 일정의 목적은 샘플 내에서 처음 높은 농도 때문에, 초기에 나타나는 급속 한 확산에 맞게. 투 석 과정 위에서 설명한 잎 반 정화, 나노 솔루션은 나노 입자, 침전, 집계 및 기타 대형 불순물을 12-14 kDa 차단 막의 숨 구멍을 통해 전달할 수 없습니다 있기 때문에. 나머지 침전, 집계 및 기타 대형 불순물을 제거 하는 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 세미 정제 나노 솔루션을 필터링 합니다. -80 ° C 냉동 고에 원뿔 튜브를 놓고 약 5 h에 대 한 동결을 순화 PEGylated AuNP (못-AuNP) 솔루션을 허용 합니다. 동결 건조 기를 사용 하 여 정화 못 AuNP을 lyophilize. 건조 하 고, 순화 된 말뚝-AuNP 4 ° C에서 사용까지 저장 합니다. 4. 동산 Fluorophores 못 AuNP에 NH2 그룹에 N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르를 사용 하 여 자기 저 접시의 센터를 통해 50 mL 둥근 바닥 플라스 크를 보호 합니다. 물 18 mL로 플라스 크를 물 자석 저 어 달걀 모양의 막대를 사용 하 여 100 rpm에서 저 어. 높은 정밀도 벤치탑 규모를 사용 하 여 4 mL 원뿔 튜브에 동결 건조 된 말뚝 AuNP의 2 밀리 그램 무게. 정전기와 튜브 표면에 못 AuNP 분말의 집착을 제거 하는 정전기 방지 총을 사용 합니다. 튜브에 물의 2 개 mL를 추가 합니다. 물 20 mL의 총에 추가 재구성의 둥근 바닥 플라스 크에 2 mL 못 AuNP 솔루션을 부 어. 계속 자기 저 어 달걀 모양의 막대를 사용 하 여 100 rpm에 혼합물을 저 어. 0.1 m M의 1 mL을 추가, pH 8.8 탄산염 20 mL 둥근 바닥 플라스 크에 포함 된 재구성된 AuNP에 버퍼. 계속 저 어. 디 메 틸 sulfoxide에 10 mg/mL 형광 NHS 에스테 르의 5 µ L를 추가 합니다.참고: 모든 형광 성 염료는이 과정에서 사용할 수 있습니다. 밤새 형광 못 저 어. 실내 온도에 그것을 유지 하 고 호 일에 커버. 다음 72 h에 대 한 초과 fluorophores 단계 3.3에에서 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 제거 합니다. 간단히, 흔들된 혼합 물, 12-14 kDa 분자량 컷오프 셀 루 로스 멤브레인의 4 L 물통을 사용 하 여 dialyze. 첫 번째 6 h에 대 한 모든 2 h 고 나머지 66 h에 대 한 모든 6-12 h 물을 변경 합니다. 아래 섹션 5에에서 설명 된 특성에 사용할 순화 형광 못 AuNP 솔루션의 1 mL를 얻을. 동결 하 고 단계 3.5-3.7에서에서 설명한 대로 4 ° C에서 스토리지에 대 한 가루 형태로 형광 나노 입자를 얻기 위해 나머지 솔루션을 lyophilize. 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 소독 하 고 모든 잠재적인 침전 한 번 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 재구성을 제거. 5입니다. 형광 PEGylated 금 나노 입자의 특성 전송 전자 현미경 (TEM)를 사용 하 여 골드 나노 코어를 시각화 하 고 크기를 측정 하 카본 코팅 메쉬 가장 격자에 순화 된 형광 못 AuNP 솔루션의 10 µ L을 드롭. 5 분 후 필터 종이 조각을 사용 하 여 신중 하 게 못 AuNPs 남겨진 형광을 포함 하는 영화까지 가장 격자의 가장자리에서 멀리 초과 액체를 심지. 80에서 형광 못 AuNPs 보기 kV와 50000-150, 000의 확대. 디지털 사진의 찍을.참고:만 금 코어 표시 됩니다 때문에 못 전자 밀도 가장에. 측정 소프트웨어를 사용 하 여 눈금 막대를 측정 비율을 설정 합니다. 약 20 골드 코어의 직경을 계산 하 고 평균 금 코어 직경을 결정 합니다.참고: 가장 이미징 시스템 자동 디지털 사진에 눈금 막대를 배치합니다. 동적 산란 (DL)을 사용 하 여 유체 나노 크기의 측정 4.2 단계에서 설명한 방식을 사용 하 여 microcentrifuge 관으로 동결 건조 된 THPC 코팅 AuNPs의 1 밀리 그램을 전송 합니다. 별도 튜브에 동결 건조 된 말뚝 AuNP의 1 밀리 그램을 전송 합니다. 각 관에 물 1 mL를 추가 하 고 투명 한 플라스틱 1 mL에 각 AuNP 솔루션을 전송. DL 악기에는 베트를 놓고 DLS 시스템에 내장 된 입자 분석기 소프트웨어를 사용 하 여 구형 유체역학 직경을 측정 합니다. 히스토그램 형식을 사용 하 여 측정 된 유체역학 직경을 플롯 합니다.참고: 막대 그래프는 크기에 의해 나노 입자 그룹. 나노 입자의 가장 큰 그룹이이 프로토콜에 합성 AuNPs의 크기를 가장 잘 설명 하는 직경을 명확히 것 이다. Fluorometric 형광 확인참고: 동일한 샘플 및 단계 5.2에서에서 베트는 형광 신호를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. DL에서는 베트를 제거 하 고는 spectrofluorometer에 삽입. 650-800 nm의 파장 범위에 따라 여기 파장 633 nm 고 읽기 내보낸된 형광 신호를 설정 합니다. 확인 하는 최대 약 665 nm, 보 건국에 대 한 방출 피크에 연결 합니다.주: 여기 및 방출 파장 fluorophore 과정에 사용에 따라 조정 됩니다. MTS11 생체 적합성을 평가 하기 위해 시험 치료 96 잘 명확한 아래 살 균 조직 문화에서 접시, Dulbecco의 수정 독수리의 매체의 100 µ L 플라스틱 (DMEM; 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스 보충) 및 3.2 x 103 셀 각 우물에.참고:이 연구에서 쥐 지방 패드 내 피 세포는 사용 됩니다. 21 우물의 총 각 (단계 5.4.3 관심의 특정 농도 대 한 참조) 7 다른 나노 입자 농도의 3 복제 수 있도록 데 사용 됩니다. 37 ° C11에서 습도 5% CO2 제어 incubators에 confluency 성장 세포 허용. 다양 한 농도의 나노 입자와 DMEM의 300 µ L 각 개별 microcentrifuge 튜브 준비. 이 연구 해야 다음 못 AuNP 농도 DMEM의 7 다른 튜브: 0 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 100 µ g/mL, 250 µ g/mL, 500 µ g/mL, 및 1000 µ g/mL. 튜브에서 DMEM 발음 0, 10, 50, 100, 250, 500, 또는 AuNP의 1000 µ g/mL를 포함 된 DMEM 미디어 100 µ L로 3 중에서 우물을 채우십시오. 세포와 나노 입자 시간, 여기에 16 h의 미리 결정 된 길이 대 한 공동 품 어를 하실 수 있습니다. 잠복기의 끝부분 1.5 단계에서 MTS/PES 혼합물을 녹여. 부 화, 후 발음 된 DMEM과 우물에서 일시 중단 됨, 느슨하게 연결 된 나노 입자. DMEM 제조 업체의 프로토콜에 따라 비율을 1:5 MTS/PES를 MTS/PES 해결책의 20 µ L 함께 신선한 DMEM의 100 µ L를 추가 합니다. 2 h 37 ° C에서 MTS/PES와 셀을 품 어.참고:이 2 h 외피 내 피 세포의 대사 활동에 의해 결정 됩니다 시간과 다른 세포 유형 4 h까지를 증가 시킬 수 있다. 기간 내에 2 h는 MTS는 DMEM 믹스 컬러 formazan으로 내 피 세포에 의해 대사는. 못 AuNP의 생체 적합성 및 세포 생존 능력의 가능성 더 색된 formazan와 시연 됩니다. 못 AuNP와 세포는 죽어가 고 기회의 독성 보다 적게 강렬한 색상으로 표시 됩니다. 492에서 흡 광도 읽어서 각의 색도계 분석 수행 호환 플레이트 리더 nm. 각 나노 입자 농도 triplicate 흡 광도 값에서 평균 흡 광도 계산 합니다. 0 µ g/mL 나노 입자를 포함 하는 우물에서 흡 광도 평균에서 얻은 값으로 평균 흡 광도 나눕니다.참고: 아무 AuNPs를 포함 하는이 우물 나노 치료 다른 우물에 관리에 대 한 응답 비율 세포 생존 능력 계산 컨트롤 역할을 합니다. 그대로 또는 역 기능 glycocalyx11 부착 내 피 세포에 나노 통풍 관의 형광 confocal 현미경 검사 법 평가 씨 1.0 x 104 셀/cm2 쥐 지방 패드 살 균 12 m m 유리 coverslips에 내 피 세포 그리고 DMEM 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스와 셀 피드. 약 3 일에 대 한 습도와 37 ° C에서 CO2 제어 incubators 전체 confluency에 성장 셀 수 있습니다. 해당 되는 경우는 glycocalyx 수정 치료를 추가 합니다. 예를 들어 2.5 x 10-6 IU heparinase III 효소 배양된 내 피 세포의 2 h 치료 특히 고착 heparan 황산 염 구성으로는 glycocalyx를 저하 됩니다.참고: 건강 glycocalyx 저하 효소의 추가 없이 5.5.1 단계에서 설명한 대로 내 피 세포를 성장 하 여 모델링할 수 있습니다. 내 피 glycocalyx 그대로 또는 렌더링 기능 장애와 16 h 550 µ g/l 또는 다른 원하는 시간에 형광 AuNPs와 내 피 세포를 품 어. 부드럽게 37 ° C 1% 소 혈 청 알 부 민에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, 100 mg/L 칼슘 및 마그네슘 100mg/L 포함)의 2 개 mL로 세포 세척. 2% paraformaldehyde 2 mL에 셀과, PBS에 0.1%도 물속에 넣으십시오 고 실 온에서 30 분에 대 한 해결 하기 위해 셀 수 있습니다. 알데하이드 고정 솔루션을 제거 하 고 3 5 분 주기 위한 실내 온도 PBS로 세포를 씻어. 1 차적인 항 체 신청, 이전 비 특정 바인딩 사이트 차단에 실 온에서 30 분 PBS에 2% 염소 혈 청 내 피 세포를 노출 합니다. 셀 완전 차단 솔루션으로 적용 해야 합니다. 하룻밤 2% 염소 혈 청에서 PBS는 glycocalyx의 heparan 황산 염 구성 요소를 4 ° c에서에서 1% 안티-heparan 황산 염 주 항 체와 내 피 세포를 품 어. 고정된 셀 항 체 솔루션 문의 완벽 하 게 인지 확인 합니다. 다음 날, 실내 온도 PBS와 항 체 3 10 분 사이클 세척 한다. 어두운 또는 알루미늄 호 일로 덮여에 실 온에서 30 분에 대 한 적절 한 형광 이차 항 체의 1:1,000 희석과 내 피 세포를 품 어. 3 10 분 사이클 실내 온도 PBS와 이차 항 체 세척 한다. 반대로 페이드 장착 매체 포함 4′, 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 핵 얼룩을 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip을 탑재 합니다. 매니큐어를 사용 하 여 하는 coverslip의 가장자리를 밀봉 하십시오. 이미지 형광 immunostained 내 피 세포와 confocal 현미경 검사 법, 시각화는 핵, heparan 황산 glycocalyx, 나노 입자, 각각을, 녹색, 파란색과 빨간색까지 채널을 사용 하 여 샘플링 합니다.