Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Lucas Moritz Wiggenhauser; Katharina Kohl; Nadine Dietrich; Hans-Peter Hammes; Jens Kroll

doi:10.3791/56674

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

의학

Изучая диабет глазами рыбы: Microdissection, визуализации и анализа взрослых tg(fli:EGFP) сетчатки сосудистую данио рерио

Published: December 26, 2017

doi:

10.3791/56674

Lucas Moritz Wiggenhauser¹, Katharina Kohl², Nadine Dietrich², Hans-Peter Hammes², Jens Kroll¹

¹Department of Vascular Biology and Tumorangiogenesis, Center for Biomedicine and Medical Technology Mannheim (CBTM), Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, ²V. Medical Clinic, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Summary

Здесь мы рассмотрим метод протокола, который позволит легко анализ сетчатки сосудистую данио рерио взрослых tg(fli:EGFP) как быстрое считывание в настройках долгосрочных сосудистых патологий, связанных с neoangiogenesis и структурные изменения.

Abstract

Диабетическая ретинопатия является ведущей причиной слепоты среди middle-aged взрослых. Рост распространенности диабета во всем мире будет сделать профилактики диабетической микрососудистых осложнений одним из ключевых исследований полей следующих десятилетий. Для управления все большее количество пациентов риску потери зрения необходимы специализированные, целенаправленной терапии и роман терапевтических препаратов. Данио рерио является установленным животной модели для развития исследований вопросов с увеличением значимости для моделирования процессов метаболизма многофакторных заболеваний. Преимущества данного вида позволяют для оптимальной визуализации и высокая пропускная способность наркотиков скрининг подходы, в сочетании с сильной способностью выбить гены интереса. Здесь мы описываем протокола, который позволит легко анализ сетчатки сосудистую данио рерио взрослых tg(fli:EGFP) как быстрое считывание в настройках долгосрочных сосудистых патологий, связанных с neoangiogenesis или судна повреждения. Это достигается через рассечение данио рерио сетчатки и целом монтаж ткани. Визуализация судов подвергаются затем достигается через конфокальная микроскопия зеленый репортер EGFP, выраженные в взрослых сетчатки сосудистую. Правильная обработка ткани приведет к лучшим результатам и менее поломки внутреннего сосуда для обеспечения визуализации неизмененном сосудистые структуры. Этот метод может быть использован в zebrafish модели заболеванием сетчатки, связаны с изменениями в архитектуре судна, а также neoangiogenesis.

Introduction

Сахарный диабет является метаболические заболевания определяется гипергликемия, результате секреции инсулина неблагополучных или неадекватной ткани ответ выделяется инсулина. ВОЗ считает, что 422 миллиона взрослых, живущих с сахарным диабетом в 2014¹ и распространенности диабета во всем мире, как ожидается, увеличится до 8-10% населения до 2035², что делает диабет одним из ключевых исследований полей в последующие десятилетия. Жизнь с хроническим высокого сахара в крови приводит к долгосрочным микрососудистых осложнений, в том числе диабетической ретинопатии, нефропатия и полинейропатии. Управления и предупреждения этих осложнений трудны; действительно диабет становится наиболее частой причиной терминальной стадии почечной болезни (ТПН), что приводит к диализа², и диабет является ведущей причиной слепоты среди middle-aged взрослых³.

Первоначальные причины микрососудистой повреждения в диабетических глазных являются хроническая гипергликемия, метаболические изменения, а также определенные факторы риска (например, артериальной гипертензии, дислипидемии), ведущих к сосудистой эндотелиальная дисфункция, перицит отсева, и капиллярные регрессии, которая приводит к бесклеточной сосудистой рукава. Результате ишемию сетчатки является причиной неоваскуляризации и повышение сосудистой проницаемости, развитие пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR)⁴. Диабетическая ретинопатия правило был обнаружен в 37% больных диабетом, хотя зрение угрожая диабетической ретинопатии было установлено в 12% отобранных белых европейских когорты в исследовании UKADS⁵. Текущее лечение можно только предотвратить дальнейшие осложнения и не смогла полностью восстановить уже индуцированных повреждений. Панретинальная фотокоагуляция, помимо гликемического контроля, является стандартной терапии для пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR), но влияет на соседних здоровых тканей, а также. Анти-VEGF вмешательства Показать многообещающие результаты как альтернативы для лазерного лечения⁶^,⁷, но в конечном итоге, специализированные, целенаправленной терапии и новые препараты необходимые для управления растущее количество пациентов риску потери зрения.

Модели установленного исследования животных диабетической ретинопатии не разделяют каждый аспект человеческой патофизиологии. Использование правильного вида для удовлетворения конкретных потребностей научных исследований вопроса является одним из наиболее существенных частей экспериментальной установки. Zebrafish эмбриона (Danio рерио) уже широко используется в научных исследованиях развития и обеспечивает оптимальные практические фон для специфических генов нокдаун или нокаут через морфолиновая или ТРИФОСФАТЫ/Cas9 техника⁸. Эти методы могут быть легко использованы в данио рерио расследовать генов, которые были определены на больших масштабах генома всей ассоциации исследований (GWAS), генерации идеи в конкретные механизмы прогрессирования заболевания и подверженность⁹. Короткие поколений время, большое количество потомства, легко и низкой стоимости обработки и растущая поддержка пробирного повысили актуальность модели данио рерио, особенно с учетом ее большой потенциал для моделирования метаболические болезни. Сохранение биологических механизмов в zebrafish было показано как основы для развития фармакологической терапии. К примеру антидиабетические препарат метформин и холестерина СИМВАСТАТИН показали «лечить» условия в моделях лагерь/дексаметазон индуцированной высокой PEPCK выражения и высоким уровнем холестерина диета индуцированной гиперхолестеринемии¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹². этот продвижение проницательность в общепрограммной сохранены метаболических механизмов подтверждается растущее количество моделей диабет данио рерио, через эксперименты таких как: чередование инкубации в решениях глюкозы, Стрептозотоцин индуцированной абляция бета-клеток, nitroreductase опосредованной бета клеток абляции с помощью пролекарство метронидазол, Моногенные диабет опосредовано через нокдаун гена pdx1 или нокаут, а также модели сопротивление увеличение инсулина в скелетной мышце ¹². эти уже созданы протоколы, упомянутые выше особенности видов, и способность эффективно управлять геном в большое количество образцов все продемонстрировать преимущества данио рерио для изучения механизмов вождение сложное заболевание процессов, а также способность к экрану для фармакологического вмешательства.

Общее понимание основных данио рерио анатомии глаза (рис. 1) необходим для диссектор с целью использования данио рерио как модель для ангиопатия сетчатки. Данио рерио глаз имеет шесть экстраокулярные мышцы, четыре прямая и две косые мышцы, которые вставляют на внешней стороне земного шара на склера¹³. Роговицы является прозрачной ткани, охватывающих объектива и продолжает непосредственно в склеры, который образует внешней оболочки глаза. Склера непрозрачна, имеет частично легкими отражающей поверхности и сильно пигментированы. Объектив, сам более шарообразные чем двойники человека. Сетчатка состоит из трех ядерных слоев нейрональных клеток, в то время как кислород предоставление сетчатки сосудистую тесно связан с внутренней ганглия слоя клеток, но не образуют субретинальное сеть. Хориоидальные сосуды, напротив, лежат между склерой и сетчатки и связанные с пигментированной эпителий сетчатки (ПЭС). Этот капиллярной сети поставляет кислород к наружной части сетчатки¹⁴.

Рисунок 1: схематически глаза взрослых рыбок данио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Простая визуализация сетчатки сосудистую достигается за счет использования трансгенных tg(fli:EGFP) данио рерио линии¹⁵. Зеленый флуоресцентный белок, выразил под контролем fli promotor в эндотелиальных клетках сосудистую является основой для визуализации через лазерный сканирующий микроскоп на более поздних этапах. Это достигается через рассечение данио рерио сетчатки и целом монтаж ткани. Эта трансгенных модель обеспечивает быстро сосудистой индикация без любое применение внутрисосудистых маркировки или целое гора иммуногистохимия. Для анализа диабетической ретинопатии в данио рерио, шаг за шагом и стандартизированной подготовки рутины должен использоваться каждый диссектор.Следующий протокол подготовки обеспечивает других исследовательских групп возможность легко оценить сосудистые изменения в открытых судов взрослых рыбок данио глаза и дать руководящие указания для создания оптимизированного рассечение обычной для данио рерио сетчатки.

Protocol

Все процедуры, в том числе шаги связанных с животных темы, были утверждены Комитетом по этике животных (Regierungspräsidium Карлсруэ) и следовать указаниям животных ухода из Гейдельбергского университета. 1. Подготовка фиксатор (4% PFA/PBS) Подготовьте фиксирующие свежие каждый день для обеспечения оптимального сохранения целостности гистологические ткани. Растворяют 0,2 г гидроокиси натрия (NaOH) в двойной 90 мл дистиллированной воды (ddH2O) постоянно помешивая при комнатной температуре. Добавьте параформальдегида 4 g (PFA) и перемешать до тех пор, пока решение совершенно ясно по крайней мере 5-10 мин для обеспечения деполимеризация макромолекул.Предупреждение: PFA является токсичным, обращаться с осторожностью. Распустить 0,84 г натрия дигидрогенфосфат (NaH2PO4) в решении и контроля рН в 7.2 через измерение. Отрегулируйте громкость до 100 мл с ddH2O и фильтровать решение через фильтровальную бумагу 3 класс. Хранить 4% PFA/PBS на льду. 2. Приготовление раствора эвтаназии Примечание: Следующие шаги были сделаны с ABTL данио рерио одичал тип деформации в общем возрасте 6-8 мес. Используйте этиловый 3-аминобензоат метан сульфонат, также под названием «tricaine» или MS-222, в концентрации 0,31 мг/мл для данио рерио эвтаназии16. Используйте 1 x яйцо воды, используемые для повышения zebrafish эмбриона, как растворитель для эвтаназии решения. Как правило контролировать глубину правильный анестезии перед началом работы с седативных рыбы, демонстрируя потери равновесия и сенсорных потерю реакции. Чтобы достичь 1000 мл 10 x яйцо воду, добавьте эти соли двойной 1000 мл дистиллированной воды (ddH2O) постоянно помешивая в следующем порядке: 10 г NaCl, 0,3 г KCl, 0,4 г CaCl2 *6 H2O, 1.32 g MgSO4 *6 H2O. 3. Фиксация данио рерио ткани Перевод 6 мл 4% раствора PFA/PBS на сэмпл в скважины шести ну пластин заранее. Усыпить взрослых рыбок данио, (ранее сохранены на стандартный света дневного цикла, например, 12 h: 12 h) 2 ч после того, как огни включите утром, размещая их в tricaine растворе и ждать, пока они достигли эвтаназии. После прекращения opercular движения, который может занять до 10 мин. Возьмите рыбу из решения эвтаназии tricaine и положить их на свежий бумажные полотенца. Высушите рыбы и использовать скальпель вырезать головы за крышечки (см. рис. 2а). Перевод главы непосредственно на prepped хорошо пластины, которые содержат свежеприготовленные фиксатором. Магазин, хорошо пластины, содержащие рыбьи головы, при 4 ° C на ночь для по крайней мере 24 часа для обеспечения фиксатором проникает глубже слоях сетчатки.Примечание: Данио рерио головы может храниться максимум 48 ч в 1 x фосфатный буфер (PBS) при 4 ° C до подготовки без соответствующей потери сигнала флуоресценции. Увеличение задержки может привести к потере целостности тканей и снижение качества изображения и поэтому следует избегать. 4. Подготовка сосудистую данио рерио сетчатки Заполните чашку Петри до трети с подогревом 2% агарозном и подождать до тех пор, пока агар фирмы. Крышка агар с ПБС создать рабочую область для того чтобы рассечь глаза.Примечание: Это позволит как сохранение подготовка пинцет и низкого давления на ткани во время рассечения, уменьшая вероятность повреждения. Все дальнейшие действия по подготовке должны быть выполнены в этой рабочей области, используя прямой щипцы #5 с тонкой советы под микроскопом рассечения с дополнительной epi освещение. Во время рассечения, используйте масштаб между x, 4.0 и 6.0, чтобы для обзора и оценки, деталям, ткани. Перевести фиксированной выборки в чашку Петри и, держа голову на поверхности среза с одной пинцет, вставьте другой удержал вместе пинцет ниже глазного яблока в орбитальной полости. Медленно открыть пинцет под глазом и сцепление зрительного нерва, затем тщательно рвать и отсоединить глаза (рис. 2B). Рисунок 2: удаление глаза взрослых рыбок данио. Вид сбоку роговицы с глаз по-прежнему в орбитальной полости и нетронутыми зрительного нерва (A). Вид сбоку роговицы с отсоединенной глаз (B). Схематически данио рерио глаза на этот шаг (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Удаление любого из четырех прямая и две косые экстраокулярные мышцы, которые все еще подключены к в глаз, а также остаточной ткани глазного, соединяющий глаз к орбитальной полости (см. рис. 3 и рис. 4). Добиться этого путем сдерживает глаз через полузакрытыми пинцет и, мягко сжимая структуру с другими пинцет, копировать его с Диаметрика движение. После захвата глазного яблока непосредственно приводит к поломке внутренних судов, этот метод является надлежащим образом нежный для сохранения сосудистую. Рисунок 3: взрослых рыбок данио глаз с экстраокулярные мышцы в фокусе. Вид сбоку с вложением экстраокулярные мышцы к левый внешний край глазных шара в фокусе (A). Вид сбоку зрительного нерва с экстраокулярные мышцы симметрично фланговые зрительного нерва (B). Схематически данио рерио глаза на этот шаг (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Используйте одноразовые иглы 27G (0,4 x 19 мм) в пункционная роговицы (рис. 4 c, красная стрелка) на внешний диапазон. Через это отверстие удерживайте роговицы с помощью пинцета, оба и слегка его разорвать. Потом тщательно работе для создания центрированным слезоточивый примерно размер соответствующих ученика. Рисунок 4: взрослых рыбок данио глаз после удаления всех мышц глазного. Вид сбоку с очищенной внешний обод окуляра глобус видимым (A).Вид сбоку зрительного нерва с зрительного нерва в середине. Светоотражающие склера не охватывает весь район вокруг нерва (красная пунктирная линия) (B). Схематически данио рерио глаза на этот шаг (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Давление на стороне роговицы глазной глобус (bulbus oculi) на уровне наружного края роговицы выше диафрагмы. Это создаст небольшую брешь и нажимаем объектив на высоту роговицы слезоточивый. Запустите пинцетов под объективом и удалить его (рис. 5A). Рисунок 5: взрослых рыбок данио глаз в процессе удаления объектив. Роговицы сбоку с объективом протолкнула роговицы слезоточивый (A). Вид сбоку роговицы с линзы возле Глазной глобус (B). Схематически данио рерио глаза на этот шаг (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Поверните глаз вниз к зрительному нерву, стоящих перед исследователем. Обратите внимание, что склеры и роговицы связаны и формируют волокнистых туника глаз лампы для защиты Чашеобразная сетчатки. (Рис. 6). Эта оболочка, состоящий из роговицы и склеры, называют также «corneosclera» и запасных частей из района вокруг зрительного нерва (рис. 4б, красная пунктирная линия). Вставьте иглу в это прекращение один раз создать отверстие между склерой и сетчатки. Рисунок 6: Corneosclera, состоящий из склеры и роговицы, который отключен от оставшихся внутриглазных тканей. Роговицы сбоку показаны продолжение полупрозрачные роговицы в пигментированных склеры (A). Вид сбоку сосредоточена на склеры частью corneosclera (B). Схематически удалены corneosclera (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Используя этот доступ с обеих пинцет, тщательно рип склеры аксиально на полосы для увеличения открытия вокруг зрительного нерва. Будьте осторожны, чтобы сохранить нетронутыми corneosclera на переходе к окружности роговицы стороне (см. рис. 6А). Держите склеры с одной пинцет и, схватив зрительного нерва с другим и вытягивать прочь, полностью удалить corneosclera из глаза и выбросьте его (рис. 6). Попробуйте разорвать любые соединения перед разделение corneosclera и оставшиеся внутриглазных тканей, как привязанность к другим структурам будет критической точки; Этот шаг обеспечит Чашеобразная структуру, состоящую из сосудистая оболочка глаза и сетчатки, содержащие сетчатки сосудистую (рис. 7). Создайте разрыв хориоидеи/НПП слоя, удерживая зачистка наружной поверхности с ОПРАВОЙ кончик иглы 27G иглы боком, оставшиеся Кубок. Используйте разрыв как точки доступа чтобы получить сцепление на слое хориоидеи/ПЭС и копировать его с помощью пинцета, оба на полосы, но сохраняют подключение к iris. Затем запустите одну пинцет под диафрагмой и ходить в цепи извне, создавая напряженность, потянув на уровне прекращено хориоидеи/НПП для достижения отряд комбинированной структуры.Примечание: Ирис должен быть отключен, чтобы не препятствовать флуоресценции при визуализации сосудов (Рисунок 8B). Схватив Ирис напрямую, чтобы удалить его может привести к обширные судна повреждения, особенно на внутренний оптический круг (МОК), поскольку Ирис до сих пор подключен к окружающих тканей. Хориоидеи слой и пигментированной эпителий сетчатки (ПЭС) могут быть разделены и часто сохраняют подключение к iris, которая позволяет для легкого удаления вторичного. Если невозможно удалить части радужки, используют природные переломный момент взрослых рыбок данио глаз экспонатов внутри фоторецепторных слой (PL), аналогично шагу 4.9, чтобы удалить радужки. Скрип над внешней оставшихся Чашеобразная сетчатки побудить сокращаемых в пл выше критической точки (рис. 11C, черная стрелка). Используйте созданный доступ для удаления в верхней части слоя при сохранении возможности подключения к iris. После этого запустить пинцетов под диафрагмой и ходить в цепи, как упоминалось ранее, чтобы отсоединить комбинированной структуры.Примечание: Один должен проявлять терпение, как весь шаг 4.9 может быть трудным, но это уход будет достичь более сосудистых результата, чем прямолинейно захвата Ирис на ОПРАВЕ ученика или Принудительное открытие, уничтожив соединения хориоидеи/НПП или фоторецептор слой без их соответствующего удаления. После этого шаг таким образом будет сохранить сетчатки сосудистого целостность, но привести к повреждению внешних слоев сетчатки. Рисунок 7: взрослых рыбок данио глаз после удаления corneosclera. Боковой вид показывает оставшиеся внутриглазных тканей с нетронутыми Ирис и зрительного нерва (A). Вид сбоку роговицы с диафрагмой в фокусе (B). Схематически данио рерио глаза на этот шаг (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Использование ножниц весной microdissection с прямой 2,5 мм передний край сократить зрительного нерва как можно ближе к сетчатки; Это позволит лучше квартиру монтаж ткани. Рисунок 8: взрослых рыбок данио глаз после удаления НПП/хориоидеи и усеченные зрительного нерва. Вид сбоку зрительного нерва показывает сетчатке с усеченным зрительного нерва (A). Вид сбоку роговицы с прямой вид на самый внутренний слой сетчатки (B). Схематически данио рерио глаза на этот шаг (C).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 5. Монтаж сетчатки сосудистую Вымойте расчлененных сетчатки в два раза по 5 минут в однократном ПБС. Для передачи сетчатки после усечения зрительного нерва, использовать лаборатории шпателем с микро ложкой конец избежать прямой обработке подвергаются ткани. Поместите каплю PBS на слайд стекла и передачи сетчатки в капли. Использовать пинцет, чтобы сохранить ткани на месте во время резки Чашеобразная структуры с помощью скальпеля для создания плоской четырехлепестковый или пяти лепесток формы зависимости от сетчатки (см. Рисунок 9). Сосать оставшиеся PBS с куском тонкой бумаги. Будьте осторожны, чтобы не коснуться сетчатки. Герб монтируется с плоским сетчатки в СМИ монтажа и крышка с coverslip. Будьте внимательны, чтобы не создавать пены, как пузырьки воздуха может исказить визуализации сосудов сетчатки. Свести к минимуму движение coverslip и уплотнения покрытия с четкой лак. 6. Визуализация сетчатки сосудистую Держите разрыв во времени между подготовкой и визуализация максимально сократить потери детализации изображения через флуоресценции потери сигнала. Хранить подготовленный сетчатки сосудистую монтирует на 4 ° C для уменьшения потери сигнала, если прямой визуализации не может быть достигнута, как ухудшения качества изображения медленно становится видимым 48 ч после приготовления. Визуализировать сетчатки сосудистую крепления через микроскопии флуоресцирования или лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.Примечание: Визуализация судна по микроскопии флуоресцирования была достигнута на 2,5 крат с временем экспозиции 2.0 s, усиления 6.0 x и гамма параметры 1,67. Для confocal микроскопии, Ar лазер (488 нм/20 МВт) на 20% мощности был использован в сочетании с фильтром возбуждения TD 488/543/633, 20 x / 0,7 NA мульти погружения цель с ddH2O погружения СМИ, а также параметры фильтра выбросов 505-560 Нм. Конфокальный изображения состоят из 4 x 4, 4 x 5 или 5 x 5 единственного изображения объединены через плитки сканирования зависит от размера сетчатки. 7. он разделы данио рерио сетчатки Примечание: Для он слоев сетчатки данио рерио, подготовить ткани как описано в протоколе до шага 4.5 и потом перейти непосредственно к шагу 7.1. Мыть enucleated глаза (после шага 4.5) в два раза по 5 минут в однократном ПБС. Впоследствии перевод ткани на 70% этиловом спирте (EtOH). На данный момент подготовленный глаза могут храниться при температуре 4 ° C до встраивания парафина. Вымойте ткань следующим образом для обезвоживания до встраивания парафин: 2 x 15 мин в 80% этаноле, 2 x 15 мин в 90% этанола, 3 x 15 мин в этанол 96%, 3 x 15 мин в 99% этаноле, 2 x 15 мин в acetone/99% этаноле (1:2), 3 x 15 мин в ацетоне. Держите ткани в парафин в 62 ° C на ночь. Тепло свежих парафин до 62 ° C и налить его в встраивание формы. Передача ткани в формы непосредственно и в быстром темпе, правильную ориентацию элемента управления глаз для нужного раздела. Впоследствии применяются внедрения кассеты к плесени и крышка с дополнительной подогревом парафина. Удалите вложения формы после того, как парафиновые блоки остыли. Нарезать 10 мкм секций парафиновых блоков на микротом и плавать их вне на водяной бане 45 ° C на поверхности воды, достаточно долго, для них, чтобы сгладить полностью. Поймать разделы на слайде стекла и слейте их вертикально, чтобы удалить лишнюю воду до сушки их на ночь в духовку на 45 ° C. Процесс разделах далее следующее расписание для deparaffinize и он пятно: 4 x 1 мин в ксилола, 1 x 1 мин в 99% этаноле, 1 x 1 мин в этанол 96%, 1 x 1 мин в 80% этаноле, 1 x 1 мин в 70% этанол, 1 x 1 мин в ddH2O, 1 x 4 мин в гематоксилином Мейера , 1 x 10 мин ddH2O, 1x2min в 0,5% эозина, 1 x 30 s ddH2O, 1 x 30 s в 80% этанола, 2 x 30 s в этанол 96%, 3 x 1 мин в 99% этаноле и 1 x 1 мин в ксилола. Возьмите стекла слайд из ксилола и быстро охватить ткани с монтажными СМИ. Избегайте позволить ткани высохнуть полностью, затем место coverslip на вершине и уплотнение окрашенных тканей.

Representative Results

Здесь мы показываем две типичные примеры морфологических сетчатки сосудистую в zebrafish взрослых tg(fli:EGFP): однажды визуализированы с флуоресцентным микроскопом (рис. 9а) и один раз с конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (рис. 9B). Выявлены сетчатки структура показывает шаблон высоко организованной. Сильный аутофлюоресценция наблюдается в данио рерио сетчатки, когда визуализированы с флуоресцентным микроскопом. Таким образом визуализация только сосудистой слоя через конфокальный сканирования рекомендуется снизить фон флуоресценции и увеличить контрастность. Для быстрее картина приобретения или ситуаций, которых достаточно качественных данных флуоресцентным микроскопом является привлекательной альтернативой. Рисунок 9: представитель фотографии взрослых tg(fli:EGFP) данио рерио сетчатки сосудистую. Показаны два типичных морфологических примеры сетчатки сосудистую: центральной артерии оптические распространяется в 5-7 магистральных сосудов, которые затем филиала в правопреемства аркад. Все дальнейшие судов слейте в продольных Вену (CV) ограничение внешней части каждого лепестка. Визуализация через микроскопии флуоресцирования 2,5 x увеличение (A). Визуализация сетчатки сосудистую Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия через комбинированные плитка сканирования одного изображения 5 x 5 (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Оптоволоконный артерии проникает сетчатки на головку зрительного нерва и, в большинстве проб, распространяется в 5-7 магистральных сосудов (Рисунок 10А). Магистральных сосудов затем филиала в правопреемства аркады и подключиться к внутренний оптический круг (МОК), также называется продольных вен (CV), обводить диск зрительного нерва на периферии плоский навесные сетчатки (см. рис. 10б). МОК является венозная судна, что стоки артериальной крови на внутренний край глазной глобус (bulbus oculi). Данио рерио сетчатки сосудистую также показывает области деятельности высоких сосудов с разветвлением капилляров и ангиогенных прорастания (рис. 10 c). Эта сосудистая деятельность основном расположен в ближайшем близости к МОК. Важно заметить, что тот же глаз может продемонстрировать обеих высоких и низких сосудистой деятельности в различных регионах сетчатки (Сравните Рисунок 10B и рис. 10 c). В общем сетчатки сосудистую данио рерио показывает больше аваскулярный пространства и меньшее количество капилляров между основной ветви, если по сравнению с, например, сетчатки мышей17. Оба глаза каждой пробы должны быть проанализированы, потому что сосудистую может варьироваться между ними и сингулярных инспекции может привести к смещению. Рисунок 10: увеличенное области визуализации сетчатки сосудистую данио рерио взрослых tg(fli:EGFP). Оптоволоконный артерии, ветвящимся магистральных сосудов (A). Сетчатки капилляров в области сосудистой низкой активности, соединяющий внутренний оптический круг (МОК) в нижней части изображения (B). Сетчатки капилляров в области сосудистой высокой активности, подключение к МОК (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Хорошо сохранились архитектура нейрональных слоёв уже присутствует в zebrafish от приблизительно 72 h сообщение оплодотворение (hpf) начиная18. Взрослый данио рерио сетчатки показывает следующие слои от изнутри наружу (рис. 11): слоя клеток ганглия (GCL), внутренний сплетениевидный слой (IPL), внутренний ядерный слой (INL), внешний сплетениевидный слой (ОБН), ядерный слой (ONL), слой фоторецептор (PL), и пигментированной эпителий сетчатки (ПЭС). Оценка сосудистой параметров от сетчатки сосудистую визуализации показан на рисунке 12. Внутренняя сетчатки сосудистую расположен на слоя клеток ганглия (GCL) (Рисунок 13B, белая коробка) во время хориоидеи капилляров будет связан с пигментированной эпителий сетчатки (ПЭС). Рисунок 11: он пятнать глаза взрослых рыбок данио. Поперечного сечения обзор весь глаз после снятия линз (A). Слоях сетчатки взрослых рыбок данио глаз19 (B). Индикация (черная стрелка) естественных переломный момент в PL (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Модели гипоксия индуцированной neoangiogenesis сетчатки показывают увеличение числа точек ветвления, ангиогенных ростки, площадь сосудистых и снижение intercapillary расстояние в zebrafish²⁰. Эти выводы поддерживают идею, что данио рерио подвержен²¹микрососудистых осложнений диабета, как ключевые выводы позднее диабетической ретинопатии включают гипоксия опосредованной neoangiogenesis, который тесно связан с VEGF выражение. Гипергликемия индуцированные изменения в сетчатке данио рерио приводят к увеличению толщины судов, но сохранить общий кучность²². Чередуя погружения в решениях глюкозы для 30 дней также уменьшается толщина IPL и INL²³. Также уже было показано непосредственное влияние глюкозы метаболитов в zebrafish как метаболические сторонники заболеванием. Дополнительные сосудистой hyperbranching наблюдалось в багажнике сосудистую zebrafish эмбриона после инкубации с Метилглиоксаль²⁴. На данный момент это не животное модель, которая обеспечивает все основные критерии диабетической ретинопатии. Ранние изменения часто встречаются, но переход в пролиферативной диабетической ретинопатии отсутствует²⁵. Данио рерио также подпадает под это определение, как мы только видели гипоксия опосредованной neoangiogenesis или гипергликемия индуцированных изменений до сих пор. Текущие результаты поддерживают идею, что данио рерио восприимчив к гипергликемии опосредованной сосудистых изменений и как животной модели потенциально может показать прогрессии в пролиферативной диабетической ретинопатии. В зависимости от силы и воздействия гипергликемии опосредованный эффект право Экспериментальная модель может привести к ишемии в некоторых областях данио рерио сетчатки и поощрять neoangiogenesis в качестве ключевых критериев пролиферативной диабетической ретинопатии. Однако как данио рерио — сравнительно новый игрок в области моделирования долгосрочных микрососудистой патологий, предстоящих диабет модели в zebrafish будет предоставить дополнительную информацию и уточнить его значение в отношении других моделей и их патологий. Например в крест tg(gata1a:DsRed) рыбки данио рерио с красной маркировкой эритроцитов в tg(fli:EGFP) линии могут использоваться одновременно визуализировать потенциальных внутриглазных кровотечениях в будущем данио рерио модели показаны микроаневризмы как предсказатель прогрессии в НДР.

Так как сетчатки сосудистую прогрессирует в правопреемства аркады, оценки intervascular расстояние, количество точек ветвления и площадь сосудистых связаны с расстояние от центральной оптической артерии. Чтобы избежать предвзятости в параметрах начисленных сосудов, требуется точка ориентации. МОК является такая структура и является весьма актуальным, поскольку области сосудистой деятельности лежат в прямой пространственной близости. Для постоянной оценки сетчатки сканирования следует разделить на несколько разделов прямоугольное изображение с последовательной расстояние до МОК. Вся Сетчатка должны быть проанализированы и численно симметрично распространены изображения. Данио рерио сетчатки показывает областей с высоким и низким капилляров и неравное распределение участков изображения может привести к дополнительным предвзятости.

Рисунок 12: пример презентации сосудистой параметров как индикация визуализации сетчатки сосудистую. Измерение intervascular расстояния (красный двойной стрелки) вблизи внутренний оптический круг (МОК) (A). Три точки ветвления (красные круги) вблизи МОК (B). Визуализация сетчатки сосудистую данио рерио с увеличенной области (красный прямоугольник) показаны прорастания судна (C). Диаметр сосуда, измеренным на определенном расстоянии (белый двойной стрелки) от центральной артерии (белый крест) (D). Судно плотность — это процент сетчатки площадь, занимаемая наложение судов (диагональ красные линии) (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для измерения intervascular расстояния, необходимо задать определенное расстояние в МОК в качестве стандарта (Рисунок 12А, белый двойной стрелки) и нарисуйте Воображаемая горизонтальная линия (Рисунок 12А, горизонтальной белой линии) параллельно с МОК. Расстояние между судов на этой строке суммируются и арифметически в среднем равняется intervascular расстояние. Ветвление очков учитываются внутри каждого изображения, всякий раз, когда судно разбивает и более чем одной сосудистой люмен продолжить с точки зрения происхождения. Это также включает в себя горизонтальных связей между капилляров. Важно оставаться в соответствии с анализом и решить, какие ветвления точки рассчитывать и держать эти правила на протяжении всего эксперимента для уменьшения ненужных вариации. Сосудистые прорастания, как показано на рисунке 12 c, это еще один параметр, который может учитываться в каждом изображении оценить влияние на сосудистую сетчатки. Ростки ангиогенных не следуют аркада как преемственность между центральной артерии и МОК и фокус вблизи наружной части сетчатки. Для оценки определенных судно диаметров, точки ориентации всегда требуется от которого заданное расстояние знаменует измерения пятно. Происхождения центральной артерии сетчатки внутри предоставляет такие руководящие указания для судов главного стебля (12D рис, белый крест). Площадь, занимаемая судов (Рисунок 12E, Диагональ красные линии) в процентах от области всей сетчатки сосудистого плотность и косвенно соотносятся аваскулярный области.

Полный конфокальный сканирования одного образца должен состоять из несколько детализированных изображений позволяет визуализацию мелких капилляров hypersprouting. Чтобы оптимизировать время и ресурсы, затрачиваемые на этот шаг, автоматизированных культиватора процедура должна использоваться с глубиной общего сканирования для каждой плитки. Неравномерным монтажа сетчатки может значительно увеличить время, затраченное для сканирования сосудистую с конфокального микроскопа. Хотелось бы только сканирование сосудов слой (рис. 13B, белый квадрат), но частичное включение GCL оптимальный подход часто необходим.Оставив избыток Длина зрительного нерва после усечения, а также сокращения для достижения плоским гора, будучи слишком коротким, может привести к неравномерным монтажа.

Рисунок 13: сравнение он окрашивание и аутофлюоресценция в сетчатке взрослых рыбок данио. Сетчатки сосудистую в фокусе выше GCL (A). Сетчатки сосудистую (белая коробка) показаны зеленый сигнал EGFP и слоях сетчатки, экспонируется сильные аутофлюоресценция ((B)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Как надлежащей подготовки сосудистую данио рерио сетчатки требует предварительной подготовки, небольшой размер выборки с неподготовленных Диссекторы и сильно меняя результаты подготовки являются основным ограничением методики. В то время как подготовка глаза данио рерио tg(fli:EGFP) дает быстрый проницательность в состояние сосудистую, техника по-прежнему использует около 20 минут рабочего времени за сетчатки для опытный исследователь. Все эти шаги подготовки для сетчатки сосудистую должна выполняться под микроскопом рассечения и необходимость Диссекторы остаться сосредоточены все время как небрежно шаг потенциально может вызвать обрыв судна. Диссектор должны практиковать регулярно, как длительное отсутствие от подготовки уменьшает вероятность диссектор сохранения целостности судна.

Кроме того дополнительная индикация через иммуногистохимия (IHC) по-прежнему ограничена, поскольку лишь небольшое количество антител, проверяемый на ткани человека и грызунов работают с данио рерио. Экспериментаторы заинтересованы в ИХС рекомендуется для поиска данио рерио специфические антитела, особенно при работе с новой цели. Кроме того рекомендуется использовать дополнительные данио рерио репортер линии, которые являются полезными для изучения клеток за сосудистую в глаза. Эта стратегия, однако, отнимает много времени, как он занимает несколько месяцев для создания линии взрослых рыбок данио, которые несут несколько трансгенных репортеры.

Тем не менее данио рерио создает уникальный спектр преимуществ. Они являются относительно небольшими и легко воспроизвести. Они могут быстро расти до взрослых этапов и их эмбрионы являются оптимальными для скрининга наркотиков. Поле легко растет и больше литературы становится доступным. С способность генерировать гена нокауты на быстрой скорости и обилие трансген флуоресценции репортер линии выбор для данио рерио сдерживается только выбранных исследований вопрос.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Katrin Bennewitz и Марлен Hausner данио рерио животноводства и оказания технической помощи. Авторы признают поддержки основной объект Live клеток Imaging Мангейм в центре для биомедицины и медицинской технологии Мангейм (DFG инст 91027/9-1). Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (международного исследования учебные группы 1874/1 «DIAMICOM», проект SP5 и SP9; Совместный исследовательский центр SFB1118, проект B1 и совместный исследовательский центр SFB/TR23 проекта Z5).

Materials

NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl_2*6H₂0	Roth	5239.2
MgSO_4*7H₂0	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Sodium dihydrogen phosphate	Roth	2370.1
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agarose	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
Petri dish	Greiner Bio one	633180
Six-well plate	StarLab	CC7682-7506
Needle	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Micro Tweezer	World Precision Instruments	14095
Microdissection Scissor	World Precision Instruments	501778
Glass slide	Carl Roth	H872.1
Coverslip 22mmx22mm	neoLab	103512222
Scalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluorescence stereomicroscope MZ10 F	Leica	NA
Confocal laser-scanning microscope SP5 DS	Leica	NA
Stereomicroscope M80	Leica	NA
Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype	NA	NA	see Reference 15
Mayer’s hematoxylin	Dr. K. Hollborn & Söhne	0088663
0.5% eosin	Dr. K. Hollborn & Söhne	NA
99,9% ethanol	Roth	9065.2
Paraffin	Merck	1,071,501,000
Xylol	Roth	4436.2
Acetone	Emsure	606-001-00-8
Microtome RM 2165	Leica	NA

References

WHO. . Global report on diabetes. , 88 (2016).
Lim, A. Diabetic nephropathy – complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Wiggenhauser, L. M., Kohl, K., Dietrich, N., Hammes, H., Kroll, J. Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature. J. Vis. Exp. (130), e56674, doi:10.3791/56674 (2017).