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의학

Medições de contratilidade do humano músculo liso uterino para auxílio de desenvolvimento de drogas

Published: January 26, 2018
doi:
10.3791/56639
, , ,
1Harris-Wellbeing Preterm Birth Research Centre, Department of Cellular and Molecular Physiology, Institute of Translational Medicine,University of Liverpool, 2School of Biomedical Sciences,The University of Queensland, 3Faculty of Chemistry, Institute of Biological Chemistry,University of Vienna, 4Institute for Molecular Bioscience,University of Queensland, 5Center for Physiology and Pharmacology,Medical University of Vienna

Summary

Este artigo descreve os protocolos experimentais para o estudo ex vivo contrações do miométrio humano e sua aplicação na descoberta de medicamentos. Esta técnica é usada para melhorar a compreensão das myometrial fisiologia e fisiopatologia, bem como para validar dados farmacológicos de sondas de pesquisa romance ou drogas leva.

Abstract

Descoberta e caracterização de novos compostos farmacêuticos ou bioquímicas sondas dependem de sistemas de ensaio robusto e fisiologicamente relevantes. Podemos descrever métodos para medir ex vivo contratilidade do miométrio. Este ensaio pode ser usado para investigar fatores e moléculas envolvidas na modulação de contração myometrial e determinar suas ações excitatórias ou inibitórias e, portanto, seu potencial terapêutico em vivo. Biópsias são obtidas de mulheres passando por cesariana entrega com consentimento informado. Tiras finas de miométrio são dissecadas, recortadas e ligadas a um transdutor de força dentro de banhos de órgão 1 mL superfused com solução salina fisiológica a 37 ° C. Tiras de desenvolver contrações espontâneas dentro de 2-3 h sob tensão jogo e permanecem estáveis por muitas horas (> 6 h). Tiras também podem ser estimuladas a se para contrair como pelos hormônios endógenos, oxitocina e vasopressina, que causam concentração-dependente modulação de frequência de contração, força e duração, que mais se assemelham a contrações em trabalho de parto. Portanto, o efeito de drogas conhecidas e novas pistas pode ser testado em contrações espontâneas e induzida pelo agonista.

Este protocolo detalha especificamente como este ensaio pode ser usado para determinar a potência de agentes conhecidos e novos, medindo seus efeitos em vários parâmetros de contração myometrial humana. Nós usamos a ocitocina – e V1a antagonistas dos receptores, ritodrine e SR49059 como exemplos de compostos conhecidos que inibem contrações de oxitocina e vasopressina-induzida e demonstram como esse método pode ser usado para complementar e validar dados farmacológicos obtidos de ensaios cell-based para auxiliar o desenvolvimento de drogas. Os efeitos dos agonistas romance em comparação com oxitocina e vasopressina também podem ser caracterizados. Enquanto nós usamos o exemplo da ocitocina / sistema de vasopressina, esse método também pode ser usado para estudar outros receptores e canais iônicos que desempenham um papel na contração uterina e relaxamento para avançar a compreensão da fisiologia humana uterina e fisiopatologia.

Introduction

O objetivo da descoberta da droga é produzir novela, potente e altamente seletivos ligantes que geram uma resposta terapêutica por ativando ou inibindo as vias de sinalização celulares. Isto exige um sistema de ensaio apropriado no qual testar compostos de chumbo, com resultados fiáveis, robustos e relevantes1. Técnicas farmacológicas, tais como ligação ao ligante-receptor e ensaios funcionais, muitas vezes empregam sistemas baseados em célula heterólogos, projetados para receptores overexpress que de outra forma não seria presente2. Enquanto essas técnicas fornecem informações valiosas para receptor farmacologia e desenvolvimento precoce de drogas, os dados obtidos podem não refletir um cenário de verdade na vivo . Portanto é importante que os dados farmacológicos de ensaios cell-based também são validados em modelos fisiologicamente relevantes.

Músculo liso uterino (miométrio) constitui a camada muscular do útero que é responsável por contrações durante o parto que efface e dilatarem o colo do útero e entregar o feto3. Contração do miométrio é espontânea; não exige entrada nervosa ou hormonal contratar4. As contrações são trazidas por despolarização espontânea da membrana celular myometrial que leva à abertura de operada a tensão Ca2 +-canais (canais do tipo L) e o influxo de Ca2 + para a célula5. Complexos de cálcio com a calmodulina e ativa a quinase da cadeia leve de miosina, que por sua vez fosforila a miosina, permitindo a formação de ciclo de ponte cruzada com actina e contração. Relaxamento é normalmente mediado por fosforilação da miosina pela miosina fosfatase e uma redução da concentração de Ca2 + através de sua extrusão de célula e/ou sequestro no retículo sarcoplasmático (SR)5,6 ,7.

Vários métodos foram desenvolvidos para estudar a função myometrial e disfunção, na vivo tocography internos e externos e cateteres de pressão intra-uterina, para a geração de células transformadas ou imortalizadas de origem myometrial8 ,9,10,11,12. Enquanto sistemas de cultura de células podem detectar se uma substância pode agir a nível celular, as tiras de tecidos dentro de banhos de órgão podem ser usadas como ferramentas para medir respostas funcionais de tecidos para reagentes farmacológicas. O banho tradicional órgão é tipicamente uma câmara de vidro aquecido grande que é capaz de exploração entre 5 e 50 mL de soro fisiológico (PSS). As tiras dentro destas câmaras grandes normalmente requerem aeração com oxigênio e grandes volumes de PSS. Tiras de tecido são dissecadas e suspenso dentro da câmara de banho e ligadas a um transdutor de força, que mede as mudanças na tensão, como durante uma contração. Tiras do miométrio de ambos os seres humanos e animais, incluindo, cobaia13, rato14, rato15, coelho16e outros17,18, têm sido utilizados por um número de grupos de pesquisa para examinar muitas questões relativas à myometrial fisiologia e patologia, incluindo trabalhos de parto prematuros e disfuncionais. Por exemplo, tiras de myometrial têm sido utilizadas para identificar os fatores que regulam e modificar a atividade miogênico19,20,21, determinar a função das organelas, como o SR22, bem como moduladores de íon a investigar os canais23,24,25,26, bombas e trocadores de27 para determinar seu papel na fisiologia myometrial.

Esta técnica ex vivo permite a avaliação do desempenho de contração do tecido e o efeito direto sobre os parâmetros da contração dos diferentes agentes para ser medido incluindo, força de contração (força), frequência e duração, bem como a integração destes valores, para gerar um índice do trabalho total realizado (esforço integral médio ou área sob a curva, AUC). Como a preparação de tira de tecido isolado constitui um modelo de mais de um tipo de célula, a resposta fisiológica do tecido inteiro pode ser medida. O banho de órgão e faixa de tecido isolado são, portanto, uma ferramenta útil em fornecer a ponte entre o trabalho de cultura celular e animal inteiro /na vivo trabalho. Daí, no campo da descoberta da droga, os efeitos de novos agentes em termos de suas excitatórios (i.e., estimulantes) ou inibitório (ou seja, relaxamento) potenciais na vivo pode ser avaliada no mais de perto. Esta técnica foi usada com sucesso no desenvolvimento da ocitocina – e V1a-ritodrine de antagonista do receptor (OTR e V1aR) como agente tocolítico, relaxando para inibir as contrações do trabalho de parto prematuro e atrasar o parto prematuro. In vitro teste de ritodrine myometrial tiras de encontrado o antagonista capaz de reduzir significativamente a ocitocina (OT)-induzido contrações28,29,30. Importante estes estudos ajudaram a validar o valor translacional de ritodrine e gerados os dados de prova de conceito precisava tomar frente a ensaios clínicos31,32,33,34 . Ritodrine agora é amplamente utilizado como a droga de escolha para atrasar o trabalho na Europa. Foram realizados estudos de prova de conceito similares para o carbetocin analógico de ocitocina mostrar o seu potencial terapêutico na prevenção da hemorragia de pós-parto a35,36,37. Outros compostos de chumbo, actualmente em desenvolvimento com este ensaio incluem retosiban (GSK221149A)38 e nolasiban (dados não publicados). Esses métodos também têm sido utilizados com sucesso para comparar entre grupos de pacientes39,40,41,42,,43,44, 45,46,47 e examinar as diferenças intraespécies.

Aqui nós descrevemos o uso do isolado ex vivo tiras de tecido de grávida miométrio humano dentro banhos de feito por órgão pequeno (1 mL) para ilustrar como esse método pode ser usado para complementar e validar dados farmacológicos obtidos de ensaios cell-based . Biópsias foram obtidas em grande parte de mulheres passando por pre-labor entrega eletiva de cesariana (CS), como eles são cirurgia planejada e, portanto, são mais fáceis agendar a coleta de biópsia, tem fácil acesso para o miométrio, e tecidos não ter sido expostos a qualquer uterotonic estimulantes ou relaxantes antes da cirurgia. No entanto, biópsias também podem ser obtidas das mulheres em fase de entrega de CS não planejada (emergência) em trabalho de parto fornecendo há tempo suficiente para plenamente o consentimento do paciente. A maioria das biópsias são obtidas durante a cirurgia do segmento uterino inferior no local da incisão cirúrgica, no entanto, também é possível obter amostras do segmento superior48,49. Em alguns casos após o parto vaginal, soco biópsias do leito placentário também foram obtidas50. No entanto, isto não é o caminho mais convencional e a quantidade de tecido myometrial obtida é pequena. Miométrio non-grávida pode ser obtido pré ou pós-menopausa as mulheres passando por histerectomia por condições ginecológicas benignas. Uma biópsia de toda a sua espessura é amostrado pós-patologia exame, do corpus inferior do colo do útero, e miométrio é retirado do meio da parede uterina, evitando as superfícies serosas e endometriais.

Protocol

Aprovação de Conselho e segurança adequada revisão institucional, ético para experiências com tecidos humanos deve estar no lugar antes de trabalhar com quaisquer tecidos humanos. Todo o trabalho descrito neste documento recebida aprovação do Comitê de ética em pesquisa Local (East Liverpool, REC Ref 10/H1002/49) e placas de revisão institucional da pesquisa e do departamento de desenvolvimento, do Liverpool mulheres Hospital e Universidade de Liverpool. Nota: Todas as biópsias descritas neste protocolo foram obtidas de mulheres em fase pré-parto eletiva entrega de CS no Hospital de Liverpool feminino e cada mulher deu escrito consentimento informado para participar. 1. soluções Preparar a solução de soro fisiológico de Krebs modificada (PSS) com a seguinte composição: 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1,2 mM de MgSO4, glicose 7,8 mM, 10,9 mM HEPES e 2,0 mM CaCl2.Nota: O volume a ser feita é determinado de acordo com o número de banhos de tecido em operação, a taxa de fluxo do sistema (1 mL/min) e estimado o comprimento do experimento, incluindo tempo de equilibração e desbotado. Ajuste o pH para 7,4 usando 4 M de NaOH. 2. tecido banho configurar Pré-aqueça o reservatório de sistema de banho de tecido para ~ 45 ° C utilizando um banho de água de recirculação fixada em 55-60 ° C.Nota: O reservatório de água na base do aparelho é aquecido a ~ 45 ° C, que após permitindo a troca de calor com o PSS na tubulação de peristáltica atravessa, garante o PSS no banho de tecido é a 37 ° C. Alguns ajustes para definir as temperaturas podem ser necessários para assegurar que a temperatura de PSS no banho tecido atinge 37 ° C. Isto pode variar dependendo do aparelho usado e definir taxas de fluxo. Alterne manualmente em qualquer outro equipamento necessário, incluindo o amplificador, aquisição de dados e sistema de gravação e bombas de sucção. Posicione cada tubo alimentador peristáltica (um tubo por banho) em torno de rolos da cabeça da bomba peristáltica. Fixe com as paradas de retenção e apertando as câmaras de compressão e bloqueio de chaves ao redor dos tubos. Coloque as extremidades livres dos tubos peristáltica alimentador em um recipiente de 1 L de PSS e ligue a bomba para permitir que o PSS perfundir continuamente para os banhos de tecido. Certifique-se de bombas de sucção estão operando corretamente e que o nível da solução no banho é constante, tal que a taxa de fluxo para o banho é igual a taxa de remoção. O nível de PSS no banho tecido pode ser ajustado manipulando-se a profundidade do tubo sucção no banho usando argila do modelador. Calibre os transdutores de força, colocando um peso conhecido (equivalente a 1 millinewton (mN, unidade de força)) para o gancho do transdutor e a deflexão detectada pelo software de aquisição de gravação.Nota: Valores podem ser ajustados no software tais que os valores registados são automaticamente convertidos em mN, eliminando a necessidade de realizar quaisquer conversões adicionais durante a análise. Calibração de transdutores de força deve ser realizada antes da montagem do tecido. 3. tecido preparação e dissecação das tiras Recolha as biópsias do miométrio humano grávida (1 – 2 cm3) no CS após o parto do bebê e placenta. Obter biópsias de espessura total (típico), em que ambos os perimetrium (camada externa serosa do útero) e decidua (camada mais interna do útero) estão presentes. Use apenas myometrial tecido (camada muscular central). Ver figura 1A-B. Remova decidua (essencial) e qualquer membranas fetais aderentes (se presente) como estes tecidos são conhecidos para produzir substâncias que podem alterar a contratilidade myometrial.Nota: Na cirurgia, amostras são colocadas em novelos equilibrado sal solução (HBSS) ou PSS fresco e armazenadas a 4 ° C. Idealmente os tecidos devem ser usados dentro de 12-16 h de cirurgia, no entanto, estudos têm mostrado sem detrimento a contratilidade após 18 h de coleção com armazenamento a 4 ° C51. Controlos adequados devem ser executados para confirmar a viabilidade do tecido e função após armazenamento prolongado a 4 ° C. Os exemplos aqui são tomados da borda superior do local da incisão segmento uterino inferior e não do segmento superior. Os segmentos superiores e inferiores do útero foram mostrados para48do contrato da mesma forma, portanto, biópsias de segmento inferiores são consideradas uma boa reflexão da atividade de myometrial do segmento superior. Preparar a área de dissecação e instrumentos necessários, incluindo: tesouras grande dissecação, pequenas Vannas para dissecação, duas pinças dissecação, pinos de dissecação e clipes de tecido de alumínio, em torno de um microscópio de dissecação com ambos fixo e zoom ampliação. Lugar a amostra da biópsia em um prato base clara silastic dissecação (ver Tabela de materiais) preenchida com PSS e cuidadosamente orientar a biópsia para que as bordas serosa e decídua são identificadas figura 1B. Utilize alfinetes para fixar a biópsia para a base do prato. O tecido permaneça hidratado com PSS durante todo o processo de dissecção. Ligue a fonte de luz do microscópio e inspecionar o tecido ao microscópio com ampliação de 10x para identificar regiões do miométrio livre de tecido cicatricial, serosa, decídua e qualquer membranas fetais aderentes se presente manualmente. Realize dissecção romba, usando uma tesoura grande dissecação para separar as duas camadas de tecido adjacente, revelando dois aviões ou folhas de músculo.Nota: Muitas vezes é mais fácil encontrar um pequeno bolso entre camadas de tecido para iniciar a separação, mas deve ter cuidado para evitar pequenos vasos na borda de biópsia como eles podem ser confundidos com ‘bolsos’. Dissecando os pinos em cada canto do tecido local para fixá-la. Inspecione os lençóis do músculo procurando regiões do músculo com fibras correndo em paralelo.Nota: Identificação de região pode ser auxiliada, seguindo a direção de pequenos capilares perfusing através do tecido. Puxando na borda de tecido também pode ajudar a identificar a direção em que as fibras estão viajando. Cortar as tiras de tecido ~ 2 mm largura x 8 mm de comprimento x 1 mm de espessura ao longo do eixo longitudinal alinhado com a direção das fibras musculares com uma tesoura pequena dissecação.Nota: Deve ter cuidado para apenas segurar o tecido pela borda de corte inicial para evitar danos. Repita o processo para dissecar o número de tiras necessárias para o experimento. Coloque cada tira em ambas as extremidades para endireitar e segura para o prato, tomando cuidado para não por estiramento do tecido. Fixar clips de tecido de alumínio em cada extremidade para que o tecido entre eles é ~ 5mm longo e cuidadosamente corte qualquer excesso de tecido (Figura 1). Transfira para um prato limpo, cheio de PSS pronta para montagem. 4. montagem dos tecidos nos banhos Transferi as tiras para os banhos de tecido experimental. Montar as tiras na horizontal, em vez de verticalmente (como em banhos tradicionais órgão) (Figura 2B). Ligue uma ponta de cada tira pelo clipe o transdutor de força, que mede a contração do tecido, e o outro para um fixo gancho ambos dentro da câmara de tecido.Nota: A capacidade do banho de tecido é ~ 1 mL que é grande o suficiente para garantir que as tiras estão completamente submersos no banho. Certifique-se das que tiras são a base de cada gancho no banho. Abra o software de gravação clicando duas vezes no ícone do software. Ajuste a gravação para cada canal, para que fique no modo de exibição na janela do canal. Ajuste a escala do eixo Y para ler entre 0-10 V (equivalente a calibração de post de 0-10 mN) pelo botão direito sobre o eixo Y, selecionando ‘escala’ e introduzindo valores mínimo e máximo de 0 a 10, respectivamente. Selecione ‘Okey’. Repita para cada gravação de canal. Pressione ‘registro’ no software para começar a gravação ao vivo.Nota: Se as tiras não são garantidas para a base de cada gancho, eles poderiam escorregar durante a contração, que aparecerá como um ‘pouco’ na gravação. Tensão do jogo vai mudar e, portanto, o pós-resvalamento contrações pode diferir. Estica o tecido em cada banho girando manualmente os Micromanipuladores anexados a cada transdutor. Siga o movimento do tecido para cima da linha de base da tela e continue a girar as Micromanipuladores até a tensão de linha de base atinge 0,2 g (~ 2 mN).Nota: O tecido imediatamente começará a relaxar (observado por uma queda na tensão de linha de base), geralmente atingindo uma tensão constante de entre 0,5 – 1 mN. Esta tensão definida foi otimizado para tiras de tecido deste tamanho em nossas condições experimentais. Se outros tecidos tamanhos a ser usado, é essencial que as investigações de relação comprimento-tensão apropriada são executadas para otimizar a força de descanso para ser aplicada. Permitir que os tecidos equilibrar para ~ 2h até surgirem contrações espontâneas.Nota: uma pequena elevação na tensão de linha de base é normalmente observada e é uma boa indicação da viabilidade do tecido, e que ele será contrátil. 5. desafiar o tecido com 40 mM de potássio (alta K+) Se não há contrações espontâneas ocorrem após 2 h de montagem, desafie as tiras com uma solução de sal de potássio elevado na qual o potássio está elevado a 40 milímetros por substituição isosmotic de NaCl por KCl. Para o alto K+, adicione o seguinte (em mM): NaCl 119,6, 40 KCl, 1.2 MgSO4, 7,8 glicose, 10,9 HEPES e 2.0 CaCl2.Nota: No músculo liso como miométrio, aplicação de alta K+ causa contração, indiretamente, abrindo canais de cálcio voltagem operada levando a máximo influxo de Ca2 + para as células do tecido. Alta K+ , portanto, pode ser usado como uma medida para testar o índice geral da integridade do tecido, bem como alcançar uma medida da resposta máxima do tecido. Coloca o tubo alimentador para o banho que contém a tira para ser desafiado em um frasco de laboratório de vidro contendo alta K+ para 1-2 min. Retorne o tubo alimentador até o contêiner do PSS. Sempre que uma resposta à alta K+ é alcançada, continue a acompanhar a tira para um mais 1h. Se não há nenhuma resposta contrátil para alta K+ ou nenhuma atividade espontânea suscitou pós alta resposta K+ , descarte a tira.Nota: O experimentador também precisa estar ciente do espaço morto (tempo de solução alcançar o banho de tecido) na tubulação de alimentação antes de avaliar a resposta ao elevado K+. Isto pode demorar de 2-3 min e dependerá de taxa de fluxo. Para garantir o fracasso completo da alta K+ dos tubos de banho e alimentador, que podem afetar a manobras subsequentes, esperar até contrações espontâneas voltar para pré alta amplitude de K+ antes de prosseguir com o experimento. 6. testando os efeitos de compostos conhecidos e romance em contração Myometrial Nota: Experimentos para testar o efeito de drogas novas e reagentes em myometrial função podem ser executados em espontânea (Figura 3A) ou contrações agonista-estimulada (Figura 3B-C). Para agonista estimular contrações, OT ou arginina vasopressina (VP) é adicionada para o PSS para dar uma concentração de 0,5 nM e é usado em todo o experimento (Figura 3B-C). A concentração de OT foi otimizada para este teste pois proporciona contrações que são fásicas em natureza40,52. Concentrações de agonistas maiores que isso pode levar a duradouras, sustentadas contrações (tônica) (ver Ref41,44 para exemplos), sob o efeito dos vários agentes é difícil de avaliar e o frame de tempo experimental precisa ser grandemente alargado para acomodar a maior duração de contrações individuais e a redução na frequência. Neste experimento de exemplo, OT ou VP é adicionado para estimular contrações então esse antagonismo por OTR conhecido e antagonistas1aR V, ritodrine e SR49059, ou por nosso romance composto [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]), pode ser avaliada. Preparem-se as concentrações da compound(s) de teste no PSS (com ou sem 0,5 nM OT/VP) diluído em um mínimo de diluição de 1/1.000, garantindo uma ampla gama de concentrações foram incluídas tais como aquelas que não eliciar uma resposta a concentrações que excedam o máximo resposta. Prepare um conjunto equivalente de diluições envolvendo volumes iguais de veículo (por exemplo, dimetilsulfóxido, acetonitrila ou água destilada).Nota: Muitas vezes é mais fácil de preparar a maior concentração, ou seja, 10-6 M (a partir de um estoque de 10-3 M) e em seguida, executar diluições em série ao longo de uma escala logarítmica (por exemplo, 10-6–10-10 M). O volume a ser preparado depende do tempo de aplicação, a taxa de fluxo do aparelho e número de tiras para ser examinado, por exemplo, para uma aplicação de 25 min do reagente e uma taxa de fluxo de 1 mL/min, um mínimo de 25 mL de cada concentração por banho de tecido é requir Ed. Aplicam-se a primeira concentração do composto no tecido, colocando o tubo alimentador para o banho de tecido em um frasco de laboratório de vidro contendo o reagente na concentração desejada.Nota: Isto deve ser feito uma vez atingida uma base estável de contrações espontâneas ou OT/VP-estimulado. Aplica a solução de controle de veículo correspondente da mesma forma para um segundo banho. Registre o tempo de aplicação (ou seja, quando o tubo alimentador foi alterado). Repita o processo para cada concentração colocando sequencialmente o tubo alimentador para o frasco de vidro de laboratório contendo a concentração próxima da série e repetir até que todas as concentrações foram aplicadas.A aplicação de cada concentração pode ser entre 15 e 30 min, mas deve ser coerente para cada concentração aplicada e entre as experiências. Aqueles que envolvem OT ou contrações VP-estimuladas tendem a exigir os longos períodos de aplicação (por exemplo, 25 min) para contabilizar a redução na frequência de contração observada sob estimulação. Experimentos preliminares para determinar o tempo ideal de aplicação devem ser realizados previamente com qualquer novo reagente sendo testado. Retorne o tubo alimentador de PSS (com ou sem OT/VP) a lavagem. Clique em ‘parar’ para finalizar a gravação ao vivo. Imediatamente, salvar os dados em uma pasta adequada e uma versão de exportação como um arquivo de ‘Mat’. 7. análise de dados Nota: Dados de captura e análise pode ser realizada por qualquer número de pacotes de software de aquisição de dados comercialmente disponíveis. Consulte Tabela de materiais para obter detalhes do software utilizado no presente protocolo. Para uma avaliação rigorosa da atividade contrátil, os parâmetros de contrações ser medidos incluem: i) amplitude de contração, ii) frequência de contração, iii) a duração da contração e integral iv) significa força (Figura 4). Esforço médio integral é o equivalente a área sob a curva de contração e, portanto, é um índice do trabalho total realizado por faixa de tecido em um determinado momento. Alguns ou todos os parâmetros podem ser analisados. No mínimo, recomenda-se que o esforço médio integral e a amplitude de contração são analisados53. Nos experimentos descritos aqui medimos mudanças na amplitude de contração e área sob a curva. Importar arquivo de the.mat para o software de análise. Ajuste a coluna correspondente ao eixo X para refletir o tempo experimental, tendo em conta a frequência do intervalo de amostragem. Experimentos são normalmente registrados a 10 Hz, correspondente a 10 amostras/s ou 600 amostras/min. Plotar os dados como um X-Y coordenar gráfico usando “plotagem | Função de linha”. Zero da linha de base da contração usando a função ‘traduzir vertical’ no software. Selecione um período apropriado de controle.Nota: Este é o período de tempo imediatamente anteriores ao pedido da primeira concentração do regente, mas igual à duração da aplicação do reagente (Figura 4A). Por exemplo, se a aplicação de drogas X está para 25 min, use a 25 min anteriores ao primeiro pedido de droga X como o controle. Leia o eixo Y, gravar a amplitude (força) de contração no pico máximo de cada contração ocorrendo num período de tempo selecionado e calcular um valor médio. Medir a duração da contração em 50% deste pico máximo de leitura fora do eixo X no início e no final de cada contração e gravar um valor médio. Conte o número de contrações que ocorrem dentro do prazo para gerar um valor de frequência. Use a função de ‘integração’ para calcular AUC (em unidades arbitrárias, u.a.) durante o período de tempo selecionado.Nota: Para gravar AUC com precisão, é essencial que a linha de base das contrações é fixada em zero no eixo Y. Sequencialmente, mover-se através de cada uma das concentrações e gravar os diferentes parâmetros de contração. Defina o controle de dados como 100% e expressar os valores obtidos sob cada concentração do reagente em percentagem deste controlam isto é, valores para a estimulação devem ser > 100%, enquanto o relaxamento deve ser < 100%.Nota: Normalizar os dados desta forma deve permitir que o usuário comparar resultados entre as tiras e tratamentos farmacológicos. Repita para cada experimento e transferir os dados para um pacote gráfico.

Representative Results

Usando este modelo, a resposta de vários agonistas e antagonistas de contração, bem como novos agentes de função conhecida ou desconhecida pode ser examinada e quantificada. Parâmetros farmacológicos padrão como CE50 e IC50 valores podem ser calculados quando os reagentes são usados em uma ampla gama de concentrações, por exemplo, 10-5– 10-9 M e adicionados em crescentes concentrações ao longo de um escala logarítmica. Experimentos de concentração-resposta a ocitocina Receptor antagonistaNeste experimento, emparelhadas tiras do miométrio humano foram cortadas conforme descrito acima e mostradas na Figura 1, montado durante o banho de tecido, conforme representado na Figura 2e permitiu equilibrar para produzir contrações estáveis de igual amplitude e frequência. As tiras foram expostas então o agonista endógeno de OTR, OT (0,5 nM) para estimular as contrações. Após um período de atividade estável sob OT (normalmente de 45 min), ritodrine foi aplicado a uma tira em crescentes concentrações ao longo de uma escala logarítmica (10-9– 10-6 M). A segunda faixa foi deixada no OT sozinho como controle de tempo. Um exemplo da resposta à ritodrine pode ser visto na Figura 5A. Tendo as contrações imediatamente anterior a primeira concentração de ritodrine como controle (100%), a amplitude e a AUC para cada concentração aplicada foi calculada como mostrado na Figura 4. Para experiências de controle de tempo, o equivalente a hora de manobras experimentais foi medido. Os dados foram então plotados e curvas montado usando a função de regressão não-linear em um pacote de software gráfico (Figura 5B-C). Em termos de calcular o efeito inibitório, a potência relativa de ritodrine foi calculada medindo-se o IC50 , que é a concentração causando metade (50%) inibitória resposta máxima. O mesmo pode ser feito para agonistas ou estimuladores de contração. Neste caso a potência do composto é calculada a partir do CE50 (a concentração causando meia resposta estimulatório máxima). Investigar a resposta de novos compostos e teste sua seletividade do ReceptorUsamos este modelo fisiologicamente relevante de ex vivo humano myometrial contrações para examinar os efeitos antagônicos de um composto recentemente sintetizado, [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) em contrações estimuladas com qualquer o nativo V1a Agonista R, VP ou o nativo agonista OTR, OT. Usamos este ensaio para validar a seletividade do receptor do INT [D-Arg8], que foi previamente determinada por métodos farmacológicos baseada em célula a ser um antagonista da V1aR mas não com o OTR54. Neste experimento, tiras myometrial humanas foram expostas a 0,5 nM VP ou 0,5 nM OT por cerca de 1h para estimular as contrações, como mostrado na Figura 3, antes de adicionar o nosso romance composto [D-Arg8] INT em aumentar as concentrações (figura 6A e Figura 6 C). isso foi então comparado com o comercialmente disponível, conhecido V1aR antagonista, SR49059 (Figura 6B). Figura 6A ilustra diminui dependente de concentração em contrações myometrial humano VP-estimulada com concentrações crescentes de INT. [D-Arg8] Os dados para a amplitude de contração e AUC para cada concentração estão resumidos na Figura 6Aii-iii. O efeito é semelhante ao mostrado para aumentar as concentrações do conhecido V1aR inibidor, SR49059, mostrado na Figura 6Bi-iii. A seletividade do INT [D-Arg8] para o V1aR mas não para o OTR é demonstrada pelo fato de que [D-Arg8] INT faz não diminuir contrações myometrial humana que tem sido estimuladas com OT (Figura 6) como amplitude e AUC manteve-se estável (Figura 6Cii-iii). Figura 1: dissecação de biópsia humana myometrial. (A), A esquema do útero humano mostrando as camadas de três tecido que compõem a parede uterina. A camada mais interna é o endométrio (decidua em seta de gravidez, vermelho), a camada média é o miométrio (seta da camada muscular, preto), que gera as contrações e a camada mais externa é o perimetrium (ou membranas serosas, seta azul) que se forma um revestimento protetor ao redor do útero. A região de interesse para a amostragem de biópsia é representada pelo retângulo preto. Uma biópsia de exemplo de uma mulher grávida durante a cesariana é mostrada em (B) com a decídua e myometrial camadas destacadas (serosa não visível). É essencial que as camadas de tecido diferentes são identificadas para que as tiras do miométrio corretamente são dissecadas para experimentação. Uma tira de exemplo do miométrio que foi dissecado e recortado é mostrada em (C). Tipicamente, 2-6 tiras são cortadas e recortadas conforme mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: órgão multi banho conjunto experimental acima usado para medir as contrações do miométrio humano. (A) tiras de miométrio são colocadas em um órgão pequeno (1 mL) banho câmaras colocadas em cima de um reservatório aquecido (i) e são superfused com solução salina fisiológica (PSS), por meio de uma bomba peristáltica (ii). O reservatório é mantido a uma temperatura definida por meio de um banho de água circulante (iii). Cada faixa é anexada a um transdutor de força (iv), que registra as mudanças no tensão durante a contração. Isto é amplificado por um amplificador de transbridge (v) e convertido num sinal digital (vi), que é gravado em um sistema de computador (vii) executando o software de aquisição associado. (B) imagem alargada de uma câmara de banho de órgão com uma tira do miométrio humano em situ (seta vermelha), banhada em PSS com uma extremidade ligado a um transdutor de força e outro para um gancho fixo. (C) visão geral esquemática do conjunto acima. Câmaras de tecido cheias de PSS continuamente são pintadas com PSS aquecido a 37 ° C, que é através de troca de calor com um reservatório de água aquecida por baixo dos banhos (mantidos a 45 ° C) e uma bomba de água circulante, situado a 55 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: espontâneas e agonista-estimulou as contrações do miométrio humano in vitro. Em condições de livre de agonista, contrações espontâneas permanecem estáveis por mais de 3 h de gravação sem perda significativa da amplitude ou área-sob-a-curva (AUC) (Aii, Aiii), demonstrando a robustez deste modelo para investigar a aplicação de vários agentes na contração espontânea. Depois de estabelecer contrações espontâneas, estáveis, 0,5 ocitocina nM (B, OT) ou vasopressina (C, VP) foi adicionado para a solução de soro fisiológico (PSS). Contrações sob estimulação também permanecem estáveis por um número de horas sem perda significativa da amplitude de contração (Bii, Cii) ou AUC (Biii, Ciii) permitindo que o efeito dos vários agentes contráteis para ser investigado na presença de myometrial agonistas. Os dados são apresentados como média ± erro-padrão da média (SEM). Nota, para contrações agonista-estimulada (B, C), o período de controle (100%) é tomado após a primeira 45 min de aplicação do agonista, uma vez que as contrações tem estabilizado. Em todos os casos, as tiras foram superfused com PSS a 37 ° C, pH 7,4 (reproduzido de Arrowsmith et al 40 , com a permissão de Ciências reprodutivas e Di Giglio et al . 54 com a permissão de Relatórios científicos sob a licença Creative Common Open Access). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: análise de dados. () Um período apropriado de controle mostrado em vermelho foi determinado selecionando contrações imediatamente anteriores ao pedido do teste composto (droga X). Este período de controle também é igual a tempo para a aplicação da droga X (por exemplo, 40 min neste exemplo). Uma vez que mediu os valores para o período de controle são definidos como 100%. Todas as medições subsequentes então são expressos como uma porcentagem do controle. (B) Existem 4 parâmetros diferentes de contração que pode ser medido: (i) a amplitude de contração que mede a força de contração (força, mN), (ii) a frequência de contração que mede a taxa de contração, (iii) a duração da contração Qual é medida em metade pico máximo de contração e (iv) área sob a curva (também conhecido como força integral, arbitrário unidades) que dá uma medida geral de trabalho feito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: gravando o efeito antagônico de ritodrine em contrações induzida pela ocitocina no miométrio humano. Uma vez que as contrações espontâneas foram estabelecidas, as contrações foram estimuladas com o agonista do receptor de ocitocina, oxitocina (OT). As contrações foram autorizadas a estabilizar sob estimulação para um mais 45 min. (A) o V1a e antagonista do receptor de OT, ritodrine foi então aplicado em crescentes concentrações ao longo de uma escala logarítmica (10-9-10-5M). As contrações durante o período anterior a primeira concentração de ritodrine foram medidas e tidos como controle (100%). A atividade sob cada concentração subsequente foi medida e expresso como uma porcentagem do controle. O mesmo foi efectuado de tiras expostas a OT sozinho usando o equivalente a hora de manobras experimentais. Dados foram plotados em software gráfico: (B, C) Mostrar curvas concentração-resposta para o efeito antagônico de ritodrine (azul) e necessário diluição do veículo (cinza, controle de tempo) na amplitude de contração induzida por OT myometrial e área sob a curva (AUC), respectivamente. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da percentagem média (SEM) de amplitude e AUC de atividade de controle (antes da aplicação do ritodrine). Valores de IC50 foram então calculados que dão a concentração na qual a meia resposta inibitória máxima (50%) para a amplitude de contração e força integral (AUC) é alcançado (reproduzido de Arrowsmith et al 40 com a permissão de Ciências reprodutivas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: testando a seletividade efeito e receptor de um romance composto na contração humana myometrial. Após contrações espontâneas do miométrio humano foram estabelecidas, as contrações foram estimuladas com o agonista do receptor de vasopressina, vasopressina (VP) (Ai, Bi) ou o agonista do receptor de ocitocina, oxitocina (OT) (Ci). O efeito da [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) e o antagonista de1aR V comercialmente disponível, SR49059 em contrações estimuladas pelo VP foi avaliado aplicando-se o aumento das concentrações dos compostos. Respostas típicas são mostradas em (Ai, Bi). O associado analisou dados de amplitude e área sob a curva (AUC) são mostrados em (ii) e (iii), respectivamente onde o efeito foi expressa como porcentagem de controle de atividade (100%). Ambos [D-Arg8] INT e o conhecido antagonista de1aR V, SR49059 causou uma diminuição de dose dependente na amplitude e AUC, apoiando o papel do INT [D-Arg8] como um antagonista dos receptores1aR V no miométrio humano. Em contraste, INT [D-Arg8] não afetou as contrações estimuladas pela OT (Ci-iii), portanto, da mesma forma para nossos resultados de ensaios de célula com base, INT [D-Arg8] mostra também a seletividade para o V1aR no miométrio humano (dados reproduzidos de Di Giglio et al 54 com a permissão de Relatórios científicos sob a licença Creative Common Open Access). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Enquanto o desenvolvimento de drogas a maioria destina-se para o tratamento de doenças humanas, pesquisa mais básica é realizada principalmente em tecidos animais. Aqui, descrevemos os métodos para investigar ex vivo contrações do miométrio humano obtidos de cirurgia que pode ser usada para resolver uma série de questões importantes relacionadas ao útero fisiologia e patologia, bem como para validar respostas funcionais para conhecidos e novos agentes farmacológicos para auxiliar o desenvolvimento de drogas. Em particular, destaca-se o uso deste teste para investigar a resposta antagônica de um conhecido OTR e V1aR antagonista competitivo, ritodrine em contrações induzida por OT myometrial grávida, bem como a determinar a resposta e o receptor seletividade de um recém-desenvolvido V1aR antagonista seletivo, INT. [D-Arg8] Demonstramos que parâmetros farmacocinéticos importantes como CE50 e IC50 podem ser calculados, que se alinham bem com os dados da farmacologia baseada em célula.

Usar várias tiras simultaneamente permite a comparação direta de múltiplos efeitos agente, experimentos de competição com antagonistas e controles de tempo e veículo apropriados. Como tiras preparam-se muitas vezes em grupos de 2, 4 ou 8, esta técnica proporciona produtividade moderada, permitindo que os testes de compostos de 2 – 4 a 6-8 (cumulativos) concentrações (por biópsia). Este método também fornece dados em tempo real para que os efeitos podem ser avaliados rapidamente e protocolos podem ser ajustados. Além disso, esta técnica pode ser usada para testar qualquer composto de interesse e tem sido usada com sucesso por um número de grupos de pesquisa focada na fisiologia myometrial e na descoberta da droga. Além de analisar compostos puros, conforme descrito neste artigo, o modelo de contratilidade uterina também tem sido e podem ser utilizado com sucesso para tela para romance uterotonic compostos de misturas, tais como preparações de ervas da medicina tradicional7 , 55 , 56.

Embora este modelo seja tecnicamente robusto e mostra boa reprodutibilidade, ele tem algumas limitações: dissecação pode ser difícil para aqueles não familiarizados com o tecido ou usando equipamento de dissecação, portanto, novos usuários vão exigir algum tempo para otimizar o tecido preparação e protocolos. Também deve ser notado que miométrio humano difere consideravelmente na aparência para outros modelos tais como o rato e o rato. A maioria dos úteros de roedores são compostos por dois cornos uterinos de tubo, cada um completo com um ovário em uma extremidade e juntou-se o colo do útero. Cada chifre definiu claramente camadas musculares longitudinais e circulares, que podem ser facilmente separadas em dissecação enquanto os tipos diferentes de fibra no miométrio humano muitas vezes estão interligados formando uma ‘malha’. Além disso, os perfis de contração do miométrio humano são muito diferentes de roedores. Mais notavelmente, contrações no miométrio humano são menos frequentes, mas mais em duração. Quadros de tempo experimentais para trabalhar com miométrio humano, portanto, são frequentemente muito mais do que modelos de roedores. Diferenças na expressão de receptores entre espécies também podem contribuir para diferenças muito marcantes na respostas aos agonistas e isso deve ter em conta se a extrapolação de resultados em toda a espécie.

Também há o número de etapas que precisam de cuidados para maximizar a saída deste sistema. Passos críticos incluem a preservação da viabilidade do tecido como tendo o cuidado ao manusear tecidos para evitar danos desnecessários durante a dissecção ou durante a montagem. Um olho qualificado é necessário dissecar tiras finas da musculatura uterina, garantindo que a orientação das fibras musculares é no sentido longitudinal e seguindo o avião do tecido, bem como evitando tecidos scar, decídua e pequenos vasos. Para fins de orientação uma vez que a amostra está no laboratório, é possível adicionar uma marca (como pequeno ponto cirúrgico) no momento da coleta para o lado da biópsia para delinear a serosas borda da borda decidual.

Os tecidos devem ser mantidos a uma constante 36 – 37 ° C durante a experimentação como função de tecido está sujeito a flutuações de temperatura. Isto pode ser conseguido com uma unidade de condicionamento de ar robusto dentro do laboratório. Perfusão constante de PSS aquecido garante que a temperatura é mantida bem como a descarga de resíduos de produtos de contração. Temperatura dentro dos banhos de órgão pode ser alterada modificando a taxa de fluxo ou ajustar a temperatura do banho de água diretamente. O tamanho de banho pequena em comparação com banhos tradicionais 5-50 mL garante um volume de negócios relativamente rápida de PSS e esmaecimento de reagentes. O banho de órgão miniaturizados conforme descrito aqui, também reduz o volume de PSS e reagentes de interesse necessário, minimizando os custos e poupar preciosos, recém desenvolvido produtos químicos. Além disso, dadas as dimensões de banho pequenas e usando um buffer de HEPES, este sistema não exige oxigenação, por exemplo, por borbulhamento o PSS com carbogênio. Padronização de tensão aplicada às tiras também é importante. Para as tiras deste tamanho (5 x 2 x 1 mm), este deve ser aproximadamente 2 mN (equivalente a ~0.2 g). Métodos alternativos incluem a aplicação de uma solução de potássio alta para induzir a contração máxima e estendendo-se até metade desta contração máxima. No entanto deve-se notar, que tensão aplicada na vivo podem ser diferentes.

Os principais desafios incluem a obtenção de tecidos de seres humanos, mas apesar de trabalhoso, tecidos humanos claramente representam mais fisiologicamente relevante (e gratificante) modelo para o estudo contração uterina em descoberta humana de doença e drogas. O tecido isolado tiras, no entanto, não necessariamente equivale a tecido na vivo como eles são isentos, por exemplo, de hormonal e nervoso de entrada que, embora não essencial para a contração, será modular contrações em vivo. Este ensaio, no entanto, oferece a oportunidade de analisar myometrial contrações de forma controlada, separada de tais influências. Também permite o efeito de fatores tais como o controle hormonal da contração (por exemplo, através de OT, VP, prostaglandinas, etc.) para ser investigado, fornecendo pistas para a regulação da função myometrial. Como os tecidos são obtidos de mulheres diferentes, naturalmente há alguma variação nos perfis contrátil espontâneas entre as amostras. Portanto, muitas vezes é necessário realizar experiências em um grande número (~ n = 10) das amostras para minimizar a variação em alguns conjuntos de dados de53. Isto é mais importante quando se compara a atividade contrátil entre diferentes grupos de pacientes. Normalizando a resposta de agonistas e antagonistas para controlar a atividade (isto é, expressa como uma porcentagem da atividade de controle ou alta K+) reduz alguns desta variação. Além disso, para reduzir a variação inter tira, dados podem ser normalizados para tira a área secional transversal medindo seu comprimento e peso post experimentação41. Isto é particularmente útil quando se comparam os padrões de contração entre diferentes grupos de pacientes.

As limitações desta técnica incluem também acesso aos tecidos frescos que requer boas relações de trabalho com o pessoal do hospital, especialmente do pessoal do teatro e os envolvidos no processo de consentimento. As permissões éticas a Comissão de revisão de Comitê de ética de pesquisa e o Instituto ou o hospital local também precisam estar no lugar. Coleção de miométrio humano é provavelmente executada durante a entrega do CS, quando o doador é passar por uma cirurgia. A biópsia é retirada do mesmo site de incisão uterina feito para entregar o bebê e, portanto, o paciente não precisar se submeter a qualquer procedimento mais adicional. Pessoal de teatro e o cirurgião realizar a biópsia precisa ser feito ciente do uso subsequente dos tecidos e que não devem ser colocados em fixador soluções tais quanto ao envio para um departamento de patologia. O prazo de tempo experimental é uma outra consideração. Experiências com tecidos humanos levar muitas horas (normalmente > 6 h) (ao invés de 2 – 3 h para uma experiência semelhante no útero de rato ou mouse), devido a frequência mais lenta de contração e o tempo de retardo de 2 – 3 h entre montagem de tecido e estabelecimento de espontânea contrações. No entanto, como temos demonstrado, as contrações do tecido humano são robustas e quando estabelecido pode contrair por muitas horas sem fadiga significativa40.

Este sistema também permite que outros desafios do trabalho na vivo a serem vencidos, incluindo a capacidade de testar reagentes farmacêuticos no tecido grávido. Esta técnica pode facilmente ser extrapolada para outras espécies, incluindo o rato através do qual os resultados iniciais podem ser confirmados antes de prosseguir mais em estudos com animais toda. Controlada a mudanças de temperatura, composição do superfusate (PSS) e pH pode ser feita facilmente imitar diferentes cenários na vivo e analisar o efeito dessas mudanças no comportamento do composto. Os princípios básicos de medição de tensão isométrica em tiras myometrial também podem ser expandidos para medição simultâneas alterações na concentração de cálcio intracelular ou pH pelo uso de Ca fluorescente ou indicadores de pH (H+) e equipamentos para detectar e fluorescência registro57,58,59,60.

No geral, o miométrio humano representa um modelo robusto e fisiologicamente relevante para caracterizar e validar novos compostos terapêuticos na descoberta da droga — ambos compostos puros e misturas. Nós temos fornecido exemplos de seu uso na descoberta da droga em relação ao sistema de OT/VP e focada emumR antagonistas OTR e V1 para mostrar como este modelo pode ser usado para determinar a eficácia do composto e potência em objectivos definidos e validar a seletividade de ligante. No entanto, deve ter em mente que essa técnica pode ser usada para estudar qualquer alvo de interesse ou o caminho que conduz à contração myometrial (ou relaxamento), bem como para auxiliar a descoberta da droga de novas metas e caminhos e avançar nossa compreensão da myometrial Fisiologia e fisiopatologia.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de ciência austríaco (FWF) através do projeto I3243 e o Conselho Europeu de investigação (CEI) no âmbito da União Europeia Horizonte 2020 programa de investigação e inovação (Convenção n 714366 de subvenção). CWG foi apoiado por uma bolsa de futuro do Australian Research Council (ARC) (FT140100730) e MM por uma comunhão de ARC descoberta precoce carreira pesquisador (DECRA) (DE150100784). SA é suportado por um Harris-bem-estar prematuro nascimento pesquisa centro fundo administrado pelo bem-estar das mulheres, UK.

Materials

Origin software Origin Lab 2015 version
Labscribe Software WPI Formally Datatrax
GraphPad Prism graphical software GraphPad Prism PRISM 5
LabTrax 4-Channel Data Acquisition WPI LAB-TRAX-4
Transbridge Transducer Amplifier WPI SYS-TBM4M
Force-displacement Transducer WPI FORT10g 10 g
BNC to BNC Cable WPI 500184
Magnetic Clamp stand WPI M10
Micrometer Reconditioned from microscopes
Peristaltic pump Gilson MINIPULS3 R4 Standard pump head
Suction pumps Various AP2 air pump
Circulating Water bath Grant Instruments TC120 5L
Perspex Tissue Bath Custom made
Water reservoir container the reallyusefulbox 7L
Tissue Hooks (fixed) Hand made in house
Peristaltic tubing Gilson F117948 PVC 2.79 mm internal diameter
Tygon Tubing Fisher Scientific various diameters R-3603
Aluminium clips Laser services, USA custom made
Stereo Zoom binocular microscope WPI PZMIV
Microscope Fiber-optic Light Source WPI PHOTONIC PL 2000
Dissecting Dishes Handmade with Sylgard
Sylgard Silicone Elastomer kit Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors WPI 50086 8.5 cm, straight edge
Iris Forceps WPI 15914 10 cm, straight edge (serrated)
Dissecting scissors WPI 14393 10 cm, straight
Dissecting pins SIGMA Z192341 B-D precision guide syringe needle 30G
HBSS SIGMA H9269
Physiological Salt Solution SIGMA various PSS
Oxytocin acetate salt SIGMA O6379
[Arg8]-vasopressin acetate salt SIGMA V9879
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Arrowsmith, S., Keov, P., Muttenthaler, M., Gruber, C. W. Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development. J. Vis. Exp. (131), e56639, doi:10.3791/56639 (2018).
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