援助医薬品開発への人間の子宮平滑筋の収縮力測定

生体実験の適切な制度的、倫理的な検討委員会と安全性承認は、任意の人間の組織で作業する前に場所でなければなりません。すべての作業説明本研究倫理委員会から承認を取得 (リバプール東, REC Ref 10/h1002 オリーブスモルト/49) と研究と開発部、リバプールの女性の病院とリバプール大学の倫理委員。 注: このプロトコルで記述されているすべての生検は、参加する前の労働リバプール女性の病院でそれぞれの女性の分娩の CS 方法を与えた同意を受ける女性から得られました。 1. ソリューション 次の組成を変更したクレブス生理食塩液 (PSS) を準備: 154 mM NaCl、KCl 5.6 mM、1.2 mM MgSO4、7.8 mM グルコース、10.9 mM HEPES、2.0 mM CaCl2。注: ボリュームを操作、システム (1 mL/分) の流量で組織浴場の数に応じて決定され、平衡とウォッシュ アウト時間を含む実験の長さを推定します。 7.4 4 M NaOH を使用して pH を調整します。 2. 組織バスの設定 ~ 45 ° c 55-60 ° C で循環水の風呂を使用して組織の風呂システム貯水池を予熱します。注: 装置の基盤に水の貯留は、縦貫、蠕動のチューブで PSS との熱交換を可能にした組織のバースの PSS は、37 ° C で確実に ~ 45 ° C に加熱はティッシュお風呂で PSS の温度が 37 ° C に達するように温度を設定するいくつかの調整が必要であります。これは器具を使用し、流量を設定によって異なります。 増幅器、データ集録、記録システム、吸引ポンプなど他の必要な機器を手動で切り替えます。 蠕動性ポンプ頭部のローラの周り蠕動フィーダー チューブ (バスあたり 1 つの管) を配置します。終了位置を保持したおよび圧縮カムを引き締め、チューブ周囲のキーをロックして固定します。PSS の 1 L 容器に蠕動フィーダー チューブの自由端し継続的に組織の浴場に灌流して PSS を許可するようにポンプを起動します。 吸引ポンプが正しく動作しているようにお風呂に流れの速度に等しい除去率、お風呂での溶液のレベルが一定を確認します。ティッシュお風呂で PSS のレベルは、モデラーの粘土を使ってお風呂で吸引チューブの深さを操作することによって調整できます。 探触子フックに知られて減量 (1 millinewton (mN, 力の単位) に相当) を配置し、集録ソフトウェアによって検出たわみを記録力変換器を調整します。注: 値は記録された値が自動的に変換 mN の分析中に、さらに変換を実行する必要性を否定するようなこと、ソフトウェアで調整できます。力変換器の校正は、組織マウントする前に行う必要があります。 3. ティッシュの準備とストリップの解剖 CS で赤ちゃんと胎盤の出産後妊娠ひと子宮 (1-2 cm3) 生検を収集します。子宮外膜 (子宮の外側の漿膜層) と脱落膜 (子宮の内層) の両方が存在 (典型的な) 全層生検を取得します。子宮筋組織 (中央筋層) のみを使用します。図 1 aBを参照してください。 これらの組織は、子宮収縮を変えることができる物質を生成する知られている (本質的な) 脱落膜との付着性の胎児膜 (存在する場合) を削除します。注: 手術でサンプル ハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) または新鮮な PSS に配置、4 ° C で保存理想的な研究を示している収縮性を損なう 4 ° C51でストレージとコレクションの 18 h の後しかし組織を外科 12-16 時間以内使用ください。4 ° C で長期保存後組織生存率および機能を確認するために適切なコントロールを行う必要があります。ここでのサンプルと上部のセグメントではなく低い子宮セグメント切開部位の上端から取得されます。子宮の下部と上部のセグメントは、同様に48の契約に示されている、それ故により低いセグメント生検と見なされます上部セグメント子宮筋活動の良い反射。 郭清範囲と必要な機器を含む準備: 大解剖はさみ、小さな Vannas 解剖はさみ、2 つの解離鉗子、郭清ピンと固定両方解剖顕微鏡、ズームの周りのアルミ組織クリップ倍率。 クリア シラスティック ベース解剖皿の上生検サンプル (材料の表を参照してください)、PSS と慎重に満たされた場所、生検をオリエンテーションは、漿膜、脱落膜のエッジを識別できるように図 1 b。 ピンを利用して、料理のベースに生検をセキュリティで保護します。組織の切離プロセス中で、PSS 水和ままを確認します。 手動で顕微鏡光源に切り替え、子宮筋の瘢痕組織、漿膜、脱落膜、および存在する場合任意の付着性胎児膜から無料の領域を識別するために 10 倍の倍率の顕微鏡で組織を検査します。 別々 の 2 つの平面または筋肉のシートを明らかに 2 つの隣接する組織レイヤーに大解剖はさみを使って鈍的切離を実行します。注: 分離を開始する組織の層の間の小さなポケットを見つけるに簡単には多くの場合、彼らは ‘ポケット’ に間違われることが、生検の端に小型船舶を避けるために注意する必要があります。 それを確保するための組織の各コーナーのピンの場所を解剖します。並列で実行されている繊維と筋の地域を探して筋のシートを検査します。注: 領域の同定は、小さな毛細血管を介して組織灌の方向に従うことによって支援が可能します。組織エッジで優しく引っ張ってはまた繊維を旅している方向を識別するを助けることができます。 組織のストリップを切り取る 〜 2 mm 幅 x 8 全長 mm x 1 mm 厚の小型解剖はさみを使って筋線維方向に揃えて長手方向軸線に沿って。注: 注意が必要だけ組織を保持するために損傷を防ぐため最初のカットのエッジ投稿。 実験に必要なストリップの数を分析するプロセスを繰り返します。 各ストリップをまっすぐにし、ストレッチに配慮、料理への組織を保護する両端ピンします。 各端のアルミ組織クリップを装着して、それらの間の組織が 〜 5 mm 長く、慎重にカット任意の過剰な組織 (図 1)。 PSS の取り付けの準備でいっぱいきれいな皿に転送します。 4. お風呂で組織をマウント 実験的組織のお風呂にストリップを転送します。(伝統的なオルガン浴場) のようにストリップを垂直ではなく水平方向にマウント (図 2 b)。 組織の収縮を測定する力トランスデューサーにクリップによって各ストリップの一端を接続し、固定する他は両方組織チャンバー内をフックします。注: 組織バスの容量は 〜 1 mL のストリップが完全にお風呂で水中に沈むことを確認するのに十分な大きさであります。 お風呂で各フックの基部にストリップを確認します。 レコーディング ソフトウェアをソフトウェア アイコンをダブルクリックして、開きます。 これは、チャネルのウィンドウ ビューで各チャネルの録音を調整します。 Y 軸、選択 ‘scale’ と入力最小値の 0 と 10、最大値をそれぞれ右クリックして 0-10 V (0-10 mN の記事の校正に相当) の間に読むに Y 軸のスケールを調整します。「OK」を選択します。各チャンネルの録音に繰り返します。 ライブ録音を開始するソフトウェアの「レコード」を押します。注: 各フックのベースにストリップが保護されていない場合 ‘ワンランク上’ の記録として表示される収縮中にスリップが。セットの張力を変更し、したがって収縮後滑りが異なる場合があります。 各トランスデューサーに接続されているマニピュレーターを手動で回して各お風呂で組織を伸ばします。ベースラインから画面の上方の組織の動きに従い、基準張力 0.2 g (~ 2 mN) に達するまでにマニピュレーターを回り続けます。注: 組織はすぐにリラックス (基準張力の低下によって記載)、開始通常 0.5-1 の間の安定した張力を達するミネソタ。この定義の緊張感は、私達の実験条件でこのサイズの組織に最適化されています。その他のサイズの組織を使用する場合は、適用する安静時の力を最適化する適切な長さ-張力関係の調査が行われているが不可欠です。 平衡のために組織を許可する 〜 2 h まで自発収縮が発生します。注: 基準張力の小さい上昇は通常観察され、組織の生存率の目安は、それは収縮されます。 5. 40 mM カリウム (高 K+) を持つ組織に挑戦 取り付けの 2 h 以下の自発収縮が発生しない場合カリウムが KCl 塩化ナトリウムの isosmotic 置換による 40 mM に上昇高カリウム塩溶液とストリップに挑戦します。高 K+(mM) で、次を追加: 40 119.6 塩化ナトリウム 2.0 CaCl210.9 HEPES 7.8 グルコース 1.2 MgSO4KCl。注: 子宮筋など平滑筋、高 K+のアプリケーション収縮を引き起こす、組織細胞への Ca2 +の最大流入につながる電圧動作カルシウム チャネルを直接開きます。高 K+は、対策として組織の整合性を最大組織反応の指標を達成するための一般的なインデックスをテストするため使用できます。 高 K+に 1-2 分を含むガラス実験室瓶に挑戦するストリップを含むバス用フィーダー チューブを配置します。 フィーダー チューブを PSS のコンテナーに戻ります。 ここで高 K+への応答を達成すると、さらに 1 時間のためのストリップの監視を継続します。高 K+収縮反応がない、または誘発自発投稿高 K+応答はありません、ストリップを破棄します。注: 実験者は、またデッド スペース (組織風呂に到達するソリューションに要する時間) を認識する必要があります。 高 K+への応答を評価する前にフィーダー チューブで。これは 2 〜 3 分かかることがあり、流量に依存します。 後続の演習に影響を与える可能性があります、バスおよび送り装置の管から高 K+の完全なウォッシュ アウトを確保するための自発収縮が進む前に前高 K+の振幅に戻るまでを待つ実験でさらに。 6. 子宮筋収縮に対する既知および新規化合物の影響をテスト 注: 自発 (図 3 a) またはアゴニスト刺激収縮 (図 3B-C) の子宮筋機能に及ぼす新規治療薬、試薬にもテストを実行できます。アゴニストの刺激収縮、OT またはアルギニン バソプレッシン (VP) が 0.5 の濃度を与える PSS に追加されます nM あり実験 (図 3 b・ C) で使用されています。自然40,52一過性である収縮を提供するので、このアッセイの OT の濃度を最適化されています。濃度アゴニストより下 (Ref41,44例についてを参照してください)、長期的な持続的なの (トニック) 収縮につながる様々 なエージェントの影響は評価することは困難と実験の時間枠周波数で個々 の収縮と削減の期間の増加に合わせて拡張する必要があります。OT または VP がので収縮を刺激するために追加されますこの例実験で知られている OTR と V1 aR 拮抗薬、atosiban、SR49059、または私たちの新規化合物 [D Arg8] によってその対立-inotocin ([D Arg8] INT) を評価できます。 PSS でテスト化合の濃度を準備 (または 0.5 nM OT/VP) 最小最大を超える濃度への応答を引き出すないなど含まれている濃度の広い範囲を確保する 1/1,000 希釈で希釈応答。 車両 (例えばジメチルスルホキシド、アセトニ トリル、または蒸留水) の平等なボリュームを含む希薄の同じセットを準備します。注: 10-6 M (10-3 M の在庫) からすなわち、最高濃度を準備し、対数スケール (例えば、10-6-10-10 M) でシリアル希薄を実行する最も簡単なです。準備するボリュームによって異なります 1 mL/分の流量と試薬の 25 分アプリケーションのアプリケーション、装置、および調査するストリップの数、例えば流量の時間、組織バスあたり各濃度の 25 mL 以上が必要ed。 組織に必要な濃度で試薬を含むガラス実験室瓶にティッシュお風呂用フィーダー チューブを配置することによって化合物の最初の濃度を適用します。注: このべき自発または OT/VP 刺激収縮の安定したベースラインが達成されれば。 2 番目のバスに同じように対応する車両制御ソリューションを適用します。 アプリケーション (すなわち、フィーダー チューブが変更されたとき) の時間を記録します。 シリーズの次の濃度を含むガラス実験室瓶にフィーダー チューブを順番に配置することによって、各濃度のプロセスを繰り返し、繰り返し、全ての濃度が適用されるまで。各濃度のアプリケーションことができます 15, 30 分間が適用各濃度と実験の間一貫しているべき。OT または VP 刺激収縮を含む (例えば、25 分) 刺激下で観察される収縮頻度の減少のために長時間アプリケーションを必要とする傾向にあります。最適なアプリケーション時間を確認する予備実験はテストされているすべての新しい試薬を事前実行必要があります。 ウォッシュ アウトする PSS (OT/副社長の有無にかかわらず) にフィーダー チューブに戻る。 ‘停止’ ライブ録音を終了するをクリックします。すぐに適切なフォルダーにデータを保存し、’.mat’ ファイルとバージョンをエクスポートします。 7. データ解析 注: データのキャプチャし、分析を任意の数の市販のデータ集録ソフトウェア パッケージによって実行できます。詳細についてはこのプロトコルで使用されるソフトウェアの材料表を参照してください。収縮能の正確な評価、測定する収縮のパラメーターが含まれます: 収縮の振幅 i)、ii) iii) 収縮、および iv) 平均力積分 (図 4) の持続期間の収縮の頻度。平均力不可欠な収縮曲線下面積と同じです、したがって組織片によって与えられた時間で合計仕事のインデックスです。パラメーターの一部またはすべてを分析することができます。最低限、平均の不可欠な力と収縮の振幅解析53がそれをお勧めします。ここで説明する実験曲線下面積は伸縮の振幅の変化を測定した. 解析ソフトウェアには、the.mat ファイルをインポートします。 サンプリング間隔を考慮して、実験の時間を反映する X 軸に対応する列を調整します。実験は通常 10 サンプル/s または 600 サンプル/分に対応する 10 の Hz で記録されます。 データを使用する X と Y 座標グラフとしてプロット」のプロット |「インライン関数。 ソフトウェアに ‘垂直翻訳’ 関数を使用して収縮のベースラインはゼロします。 適切なコントロール期間を選択します。注: これは摂政の最初濃度の試薬 (図 4 a) の適用期間に等しいのアプリケーションの直前の期間です。例えば、25 分の薬 X アプリケーションの場合、コントロールと薬物 X の最初のアプリケーションの前 25 分を使用します。 Y 軸をオフに読んで、最大ピーク時に、選択した期間に発生するそれぞれの収縮の収縮の振幅 (力) を記録し、平均値を計算します。 先頭と末尾の各収縮に X 軸をオフに読んで、この最大ピークの 50% 収縮の持続時間を測定し、平均値を記録します。 周波数の値を生成する時間枠で発生する収縮の数をカウントします。 AUC を計算する「統合」機能を使用して (任意の単位 a.u.) 選択されている期間。注意: AUC を正確に記録するには、が重要です収縮のベースラインが Y 軸の 0 に設定されています。 順番に各濃度を移動し、収縮のさまざまなパラメーターを記録します。 コントロール データを 100% で設定およびエクスプレスこの割合として試薬濃度下で得られた値はすなわち制御、刺激の値をする必要があります > 100% 緩和する必要がありますしながら < 100%。注: この方法ではデータの正規化のストリップおよび薬理学的治療結果を比較するユーザーをようにします。 各実験の繰り返し、グラフィカルなパッケージにデータを転送します。