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의학

Mesures de contractilité du Human Muscle lisse utérin à l’aide le développement de médicaments

Published: January 26, 2018
doi:
10.3791/56639
, , ,
1Harris-Wellbeing Preterm Birth Research Centre, Department of Cellular and Molecular Physiology, Institute of Translational Medicine,University of Liverpool, 2School of Biomedical Sciences,The University of Queensland, 3Faculty of Chemistry, Institute of Biological Chemistry,University of Vienna, 4Institute for Molecular Bioscience,University of Queensland, 5Center for Physiology and Pharmacology,Medical University of Vienna

Summary

Cet article décrit les protocoles expérimentaux pour l’étude ex vivo des contractions du myomètre humain et leur application dans la découverte de médicaments. Cette technique est utilisée pour améliorer la compréhension du myomètre physiologie et pathophysiologie ainsi quant à valider les données pharmacologiques des sondes de recherche inédites ou drogue conduit.

Abstract

Découverte et la caractérisation de nouveaux composés pharmaceutiques ou sondes biochimiques reposent sur des systèmes de dosage solide et physiologiquement pertinents. Les auteurs décrivent les méthodes pour mesurer la contractilité ex vivo myomètre. Ce test peut être utilisé pour étudier les facteurs et les molécules impliquées dans la modulation de la contraction du myomètre et de déterminer leurs actions excitatrices ou inhibitrices et donc leur potentiel thérapeutique in vivo. Biopsies sont obtenus à partir des femmes subissant une livraison césarienne avec le consentement éclairé. Fines lamelles de myomètre sont disséqués, découpés et attachés à un capteur de force au sein de bains 1 mL superfusés avec une solution saline physiologique à 37 ° C. Bandes de développer des contractions spontanées dans les 2 – 3 h sous tension réglée et restent stables pendant de longues heures (> 6 h). Bandes peuvent aussi être stimulées pour les contrats tels que les hormones endogènes, l’ocytocine et la vasopressine, qui causent la modulation de dose-dépendante de la fréquence de contraction, la force et la durée, plus ressemblent à des contractions dans le travail. Par conséquent, l’effet de drogue connus et nouveaux prospects peut être testé sur des contractions spontanées et induites par l’agoniste.

Ce protocole détaille précisément comment ce test peut être utilisé pour déterminer la puissance des agents connus et nouveaux en mesurant leurs effets sur les différents paramètres de la contraction du myomètre humain. Nous utilisons l’ocytocine – et antagonistes des récepteurs1 a V, atosiban et SR49059 comme des exemples de composés connus qui inhibent les contractions induite par l’ocytocine et la vasopressine et démontrent comment cette méthode peut servir à compléter et à valider données pharmacologiques obtenues à partir des analyses cellulaires pour faciliter le développement de médicaments. Les effets des agonistes nouveaux par rapport à l’ocytocine et la vasopressine peuvent aussi être caractérisées. Alors que nous utilisons l’exemple de l’ocytocine / système vasopressine, cette méthode peut également être utilisé pour étudier les autres récepteurs et canaux ioniques qui jouent un rôle dans la contraction utérine et la détente pour faire progresser la compréhension de la physiologie humaine utérine et physiopathologie.

Introduction

L’objectif de découverte de médicaments est de produire le roman, puissant et des ligands hautement sélectifs, qui génèrent une réponse thérapeutique par l’activation ou l’inhibition des voies de signalisation cellulaires. Cela nécessite un système de test approprié permettant de tester des composés de plomb avec des résultats fiables, robustes et pertinentes1. Techniques pharmacologiques telles que la liaison du ligand-récepteur et essais fonctionnels emploient souvent les systèmes basés sur les cellules hétérologues, machinés pour récepteurs overexpress qui, autrement, ne seraient pas présents2. Tandis que ces techniques fournissent des indications précieuses pour la pharmacologie des récepteurs et du développement de la drogue, les données obtenues peuvent ne pas refléter un scénario vrai in vivo . Il est donc important que les données pharmacologiques des analyses cellulaires sont également validées dans des modèles physiologiquement pertinents.

Muscle lisse utérin (myomètre) constitue la couche musculaire de l’utérus qui est responsable des contractions pendant l’accouchement qui efface et de dilatent le col de l’utérus et de livrer le foetus3. Contraction du myomètre est spontanée ; il ne nécessite pas d’apport hormonal ou nerveux à se contracter de4. Les contractions sont provoquées par une dépolarisation spontanée de la membrane cellulaire de myomètre qui conduit à l’ouverture de la tension Ca2 +-canaux (canaux de Type L) et l’influx de Ca2 + dans la cellule5. Complexes de calcium avec la calmoduline et active la kinase des chaînes légères de la myosine qui phosphoryle à son tour permettant à pont Croix cycle de formation avec l’actine et la contraction de la myosine. Détente est généralement véhiculée par la phosphorylation de la myosine par la myosine phosphatase et une réduction de la concentration de Ca2 + par l’intermédiaire de son expulsion de la cellule et/ou séquestration dans le réticulum sarcoplasmique (SR)5,6 ,,7.

Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier la fonction myométriale et dysfonction, partir en vivo tocography internes et externes et les sondes de pression intra-utérine, à la génération des cellules transformées ou immortalisées d’origine myométriales8 ,9,10,11,12. Tandis que les systèmes de cultures cellulaires peuvent détecter si une substance peut agir au niveau cellulaire, les bandes de tissus à l’intérieur des bains peuvent servir comme outils pour mesurer les réponses fonctionnelles des tissus entiers aux réactifs pharmacologiques. La préparation traditionnelle est généralement une chambre grand verre chauffant qui est capable de tenue entre 5 et 50 mL de sérum physiologique (PSS). Bandes au sein de ces vastes chambres nécessitent généralement l’aération avec l’oxygène et de grands volumes de PSS. Bandes de tissu sont disséqués et suspendus dans la salle de bain et attachés à un capteur de force, qui mesure la variation de tension, comme pendant une contraction. Bandes du myomètre des humains et des animaux, y compris, le cobaye13,14de la souris, rat15, lapin16et d’autres de17,18, ont été utilisées par un certain nombre de groupes de recherche afin d’examiner plusieurs questions relatives à myométriales physiologie et pathologie, y compris le travail prématuré et dysfonctionnelle. Par exemple, myométriales bandes ont été utilisés pour identifier les facteurs qui régulent et modifier l’activité myogène19,20,21, déterminer la fonction des organites tels que le SR22, ainsi que enquête sur les modulateurs de l’ion canaux23,24,25,26, pompes et échangeurs27 afin de déterminer leur rôle dans la physiologie du myomètre.

Cette technique ex vivo permet l’évaluation du rendement de la contraction des tissus et l’effet direct de différents agents sur les paramètres de la contraction à mesurer notamment, force de contraction (résistance), fréquence et durée, ainsi que la intégration de ces valeurs, à générer un index du travail total effectué (moyenne force intégrante ou aire sous la courbe, AUC). La préparation de bandes de tissus isolés constituant un modèle de plus d’un type de cellule, la réponse physiologique du tissu entier peut être mesurée. Le bain d’orgue et de la bande de tissus isolés sont donc un outil utile dans la fourniture de pont entre le travail de culture cellulaire et animal entier /in vivo de travail. C’est pourquoi, dans le domaine de découverte de médicaments, les effets de nouveaux agents en ce qui concerne leur excitateurs (c.-à-d.stimulant) ou inhibiteurs (c.-à-d., relaxation) potentiels in vivo peut être évaluée plus étroitement. Cette technique a été utilisée avec succès dans le développement de l’ocytocine – et V1 a-atosiban antagoniste du RECEPTEUR (OTR et V1 aR) comme agent tocolytique d’inhiber les contractions de travail prématuré et retarder l’accouchement prématuré. In vitro , tests d’atosiban sur bandes myométriales trouvé l’antagoniste capable de réduire de façon significative l’ocytocine (OT)-induit des contractions28,29,30. Ce qui est important, ces études a permis de valider la valeur translationnelle d’atosiban et généré des données de validation nécessaires à prendre vers l’avant pour les essais cliniques31,32,33,34 . Atosiban est maintenant employé couramment comme le médicament de choix pour retarder le travail en Europe. De validation des études similaires ont été réalisées pour la carbétocine analogiques de l’ocytocine montrer son potentiel thérapeutique dans la prévention post-partum hémorragie35,36,37. Autres composés de plomb en cours de développement pour cette analyse comprennent retosiban (GSK221149A)38 et nolasiban (données non publiées). Ces méthodes ont également été utilisées avec succès pour comparer entre les groupes de patients39,40,41,42,43,44, 45,46,47 et examiner les différences intra-espèces.

Nous décrivons ici l’utilisation de bandes de tissus isolés ex vivo enceinte myomètre humain au sein de bains petite (1 mL) sur mesure pour illustrer comment cette méthode peut servir à compléter et à valider les données pharmacologiques obtenues à partir des analyses cellulaires de . Biopsies ont été obtenues en grande partie de femmes qui subissent un pré labor livraison élective de césarienne (CS) comme ils sont prévues de la chirurgie et sont donc plus faciles de planifier la collecte de la biopsie, ont un accès facile pour le myomètre, et tissus ne seront pas ont été exposés à aucune stimulants d’utérotonique ou relaxants musculaires avant la chirurgie. Cependant, des biopsies peuvent également provenir de femmes subissant des imprévus (d’urgence) livraison de CS dans le travail à fournir il y a suffisamment de temps pour pleinement le consentement du patient. La plupart des biopsies sont obtenus au cours de la chirurgie par le segment utérin inférieur au site d’incision chirurgicale, mais il est également possible de se procurer des échantillons sur le segment supérieur48,49. Dans certains cas, suite à un accouchement vaginal, biopsies punch du lit placentaire ont aussi été obtenus50. Cependant, ce n’est pas la voie plus classique et la quantité de tissu myométriales Récupérée est faible. Non enceinte myomètre peut être obtenue avant ou après la ménopause les femmes subissant une hystérectomie pour des affections gynécologiques bénignes. Une biopsie de pleine épaisseur est échantillonnée pathologie après examen, extraites du corpus inférieur du col de l’utérus, et myomètre est pris au milieu de la paroi utérine, en évitant les surfaces séreux et l’endomètre.

Protocol

Approbation de Conseil d’administration et de la sécurité examen institutionnel, éthique approprié pour des expériences avec des tissus humains doit être en place avant de travailler avec des tissus humains. Tous les travaux décrits dans les présentes a reçu l’approbation de la Commission d’éthique de la recherche locale (East Liverpool, REC Ref 10/H1002/49) et les comités de révision institutionnelle de la recherche et développement Département, Liverpool femmes hôpital et Université de Liverpool. Remarque : Toutes les biopsies décrites dans le présent protocole ont été obtenues de femmes qui subissent un travail préalable élective livraison de CS à l’hôpital de Liverpool femmes et chaque femme a donné consentement éclairé écrit à participer. 1. les solutions Préparer une solution de sérum physiologique mis à jour le Krebs (PSS) avec la composition suivante : 154 mM NaCl, KCl 5,6 mM, 1,2 mM MgSO4, 7,8 mM de glucose, 10,9 mM HEPES et 2,0 mM CaCl2.Remarque : Le volume à effectuer est déterminé selon le nombre de préparations de tissus en fonctionnement, le débit du système (1 mL/min) et longueur estimée d’expérience, y compris les temps d’équilibration et de lavage. Ajuster le pH à 7.4 à l’aide de 4 M de NaOH. 2. tissu bain mis en place Préchauffer la bâche du circuit bain tissu ~ 45 ° c à l’aide d’un recirculation bain-marie réglé à 55-60 ° C.NOTE : Le réservoir d’eau dans la base de l’appareil est chauffé à ~ 45 ° C, ce qui, après avoir laissé pour l’échange de chaleur avec le PSS du tube péristaltique traversant, assure le SSP dans le bain de tissu est à 37 ° C. Quelques ajustements pour régler les températures peuvent être nécessaires pour s’assurer que la température du SSP dans le bain de tissu atteint 37 ° C. Cela peut varier selon l’appareil utilisé et la valeur des débits. Allumez manuellement tout autre équipement nécessaire, y compris l’amplificateur, d’acquisition de données et système d’enregistrement et pompes aspirantes. Positionner chaque tube péristaltique chargeur (un tube par bain) autour des rouleaux de la tête de pompe péristaltique. Fixer avec les arrêts retenues et en serrant les cames de compression et de verrouillage des touches autour des tubes. Placez les extrémités libres des tubes péristaltique mangeoire dans un récipient de 1 L de SSV et démarrer la pompe pour permettre le PSS à perfuse continuellement dans les bains de tissus. S’assurer que les pompes aspirantes fonctionnent correctement et que le niveau de solution dans le bain est constant telle que la vitesse d’écoulement dans le bain est égal au taux d’élimination. Le niveau de SSV dans le bain de tissu peut être réglé en manipulant la profondeur du tube d’aspiration dans la baignoire à l’aide d’argile de la modeler. Étalonner les capteurs de force en plaçant un poids connu (équivalent à 1 millinewton (mN, unité de force)) au crochet du transducteur et la déflexion détectée par le logiciel d’acquisition d’enregistrement.NOTE : Les valeurs est réglable dans le logiciel tel que les valeurs enregistrées sont automatiquement convertis en mN niant la nécessité d’effectuer toutes les conversions supplémentaires pendant l’analyse. Étalonnage de capteurs de force doit être effectuée avant le montage de tissus. 3. tissu préparation et la Dissection des bandelettes Percevoir des biopsies du myomètre humain enceinte (1 à 2 cm3) au CS après l’accouchement du bébé et placenta. Obtenir des biopsies toute son épaisseur (typique), où sont trouvent les perimetrium (couche séreuse externe de l’utérus) et decidua (couche la plus interne de l’utérus). Utiliser seulement myométriales tissulaire (couche de muscle central). Voir Figure 1 a-B. Enlever decidua (essentiel) et des membranes foetales adhérentes (si présent) que ces tissus sont connues pour produire des substances qui peuvent altérer la contractilité myométriale.Remarque : En chirurgie, échantillons sont placés dans Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ou fraîches PSS et stockés à 4 ° C. Idéalement tissus doivent être utilisés dans les 12-16 h de la chirurgie, mais des études n’ont montré aucun préjudice à la contractilité après 18 h de collection avec stockage à 4 ° C51. Des contrôles appropriés doivent être effectuées pour confirmer la viabilité des tissus et la fonction après un stockage prolongé à 4 ° C. Les exemples ici sont prises par le bord supérieur de l’incision de segment utérin inférieur et non par le segment supérieur. Les segments inférieurs et supérieurs de l’utérus ont démontré que les contrats de même48, d’où des biopsies de segment inférieurs sont considérés comme un bon reflet de l’activité myométriale segment supérieur. Préparer la zone de dissection et les instruments nécessaires, y compris : ciseaux de dissection importante, petits ciseaux de dissection de Vannas, deux pinces de dissection, épingles de dissection et clips de tissu en aluminium, autour d’un microscope à dissection avec fixes et zoom grossissement. Place l’échantillon de biopsie sur un plat de dissection clairement axée sur les silastic (voir Table des matières) remplie de PSS et soigneusement orientez la biopsie de sorte que les bords de la séreuse et caduque sont identifiées Figure 1 b. Utilisez épingles pour fixer la biopsie à la base du plat. Assurez-vous que le tissu reste hydraté avec PSS tout au long du processus de dissection. Manuellement, allumez la source de lumière de microscope et inspecter le tissu au microscope au grossissement de 10 x pour identifier les régions du myomètre sans cicatrice, séreuse, caduque et des membranes foetales adhérentes s’il est présent. Effectuer par dissection par clivage à l’aide de ciseaux de dissection importante pour séparer les deux couches de tissus adjacents, révélant deux avions ou les feuilles du muscle.Remarque : Il est souvent plus facile de trouver une petite poche entre les couches de tissu pour commencer la séparation, mais il faut pour éviter les petits vaisseaux à la pointe de la biopsie car ils peuvent être confondus avec des « poches ». Lieu de dissection broches sur chaque coin du tissu pour le fixer. Inspectez les feuilles du muscle à la recherche de régions du muscle avec des fibres en cours d’exécution en parallèle.Remarque : Identification de la région peut être facilitée en suivant la direction de petits capillaires perfusant au travers du tissu. Traction douce sur le bord du tissu peut également aider à identifier la direction dans laquelle les fibres sont déplacent. Découper des bandes de tissu ~ 2 mm largeur x 8 mm de long x 1 mm d’épaisseur le long de l’axe longitudinal aligné avec la direction des fibres musculaires à l’aide de ciseaux de dissection petit.Remarque : Il faut seulement tenir le tissu par le bord de coupe initial pour éviter tout dommage. Répétez le processus pour disséquer le nombre de bandes nécessaires pour l’expérience. Épinglez chaque bande aux deux extrémités pour redresser, puis fixer sur le plat, en faisant n’attention pas d’étirement du tissu. Fixer les agrafes de tissu en aluminium à chaque extrémité pour que le tissu entre eux est ~ 5 mm longtemps et soigneusement découper n’importe quel tissu excédentaire (Figure 1). Transférer dans un plat propre rempli de PSS prêt à être monté. 4. montage des tissus dans les bains Transférer les bandes aux bains tissu expérimental. Monter les bandes horizontalement plutôt que verticalement (comme dans les traditionnels bains) (Figure 2 b). Branchez une extrémité de chaque bande par le clip pour le capteur de force, qui mesure la contraction des tissus, et l’autre à un taux fixe crochet tant à l’intérieur de la chambre de tissu.Remarque : La capacité de la préparation tissulaire est ~ 1 mL qui est assez grand pour s’assurer que les bandes sont complètement immergés dans le bain. S’assurer que les bandes sont à la base de chaque crochet dans le bain. Ouvrez le logiciel d’enregistrement en double cliquant sur l’icône du logiciel. Régler l’enregistrement pour chaque canal afin qu’il soit visible dans la fenêtre de canal. Ajuster l’échelle de l’axe Y à lire entre 0-10 V (équivalent à 0-10 mN après calibrage) par un clic droit sur l’axe des Y, en sélectionnant « l’échelle » et saisie valeurs minimales et maximales de 0 et 10, respectivement. Sélectionnez « OK ». Répétez pour chaque enregistrement de canaux. Appuyez sur « enregistrer » sur le logiciel pour lancer l’enregistrement live.Remarque : Si les bandes ne sont pas fixés à la base de chaque crochet, ils pourraient glisser lors de la contraction qui apparaîtra comme un « cran » sur l’enregistrement. La tension réglée va changer et donc glissement après les contractions peut-être différer. Étirez le tissu dans chaque bain en tournant manuellement les micromanipulateurs attachés à chaque transducteur. Suivre le mouvement du tissu vers le haut de ligne de base sur l’écran et continuer à tourner les micromanipulateurs jusqu’à ce que la tension de référence atteint 0,2 g (environ 2 mN).NOTE : Le tissu commencera immédiatement à se détendre (noté par une chute de tension de référence), généralement pour atteindre une tension constante d’entre 0,5 à 1 mN. Cette tension définie a été optimisée pour les bandes de tissus de cette taille dans nos conditions expérimentales. Si les autres tissus de tailles doivent être utilisés, il est essentiel que les enquêtes relation tension-longueur appropriée sont effectuées pour optimiser la force au repos à appliquer. Laissez les tissus s’équilibrer pendant ~ 2 h jusqu’à ce que surviennent des contractions spontanées.NOTE : une petite élévation dans la tension de référence est habituellement observée et est un bon indicateur de la viabilité des tissus et qu’il sera contractile. 5. contestant le tissu avec du Potassium 40 mM (K haute+) Si pas de contractions spontanées se produisent après 2 h de montage, contester les bandes avec une solution de sel de potassium élevé dans lequel potassium est élevée à 40 mM par substitution isoosmotique du NaCl de KCl. Pour le haut K+, ajoutez le code suivant (en mM) : 119,6 NaCl, 40 KCl, 1,2 MgSO4, 7,8 glucose, 10,9 HEPES et 2,0 CaCl2.Remarque : Dans le muscle lisse comme le myomètre, application de haute K+ provoque la contraction en ouvrant indirectement les canaux calciques voltage exploité menant à maximale influx de Ca2 + dans les cellules des tissus. Haute K+ donc utilisable comme une mesure pour tester l’indice général de l’intégrité des tissus mais aussi réaliser une mesure de réaction tissulaire maximale. Placer le tube d’alimentation pour le bain contenant la bande à être contestée dans une bouteille en verre laboratoire contenant K haute+ pendant 1-2 min. Retourner le tube d’alimentation vers le conteneur du PSS. Lorsqu’une réponse à haute K+ est atteint, continuer à suivre la bande pendant une 1 h supplémentaire. Si il n’y a aucune réponse contractile à haute K+ ou par la poste d’aucune activité spontanée a suscité une réponse élevée K+ , jetez la bandelette.Remarque : L’expérimentateur doit également être au courant de l’espace mort (temps nécessaire à la solution atteindre la préparation tissulaire) dans le tuyau d’alimentation avant d’évaluer la réponse à haute K+. Cela peut prendre 2-3 min et dépendra du débit. Pour assurer le lavage complet du haut K+ des tubes bain et alimentation, qui pourraient affecter les manœuvres suivantes, attendre contractions spontanées retournent dans pré haute amplitude K+ avant de continuer plus loin avec l’expérience. 6. tester les effets des composés connus et nouveaux sur la Contraction du myomètre Remarque : Des expériences pour tester les effets de nouveaux médicaments et réactifs sur myométriales fonction peuvent être effectuées sur spontanée (Figure 3 a) ou des contractions stimulée par l’agoniste (Figure 3 b-C). Pour agoniste stimule les contractions, OT ou arginine vasopressine (VP) est ajoutée à la PSS pour donner une concentration de 0,5 nM et est utilisé tout au long de l’expérience (Figure 3 b-C). La concentration de l’OT a été optimisée pour ce test, car il fournit des contractions qui sont phasiques dans nature40,,52. Les concentrations d’agonistes plus grande que cela peut entraîner des contractions (tonique) de longue durées, soutenues (Voir Réf41,44 pour exemples) sous dont l’effet de divers agents est difficile à évaluer et le délai d’exécution expérimentale doit être grandement élargi pour tenir compte de la durée des contractions individuelles et réduction de fréquence. Dans cette expérience exemple, OT ou VP est ajouté pour stimuler les contractions alors que l’antagonisme par OTR connu et V1 aR antagonistes, atosiban et SR49059, ou par notre nouveau composé [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]), peut être évaluée. Préparer les concentrations du composé d’essai de PSS (avec ou sans 0,5 nM OT/VP) dilué au minimum de la dilution de 1/1 000, qui garantit un large éventail de concentrations sont incluses telles que celles qui ne pas permis d’obtenir une réponse à des concentrations qui dépassent le maximum réponse. Préparer un ensemble équivalent de dilutions impliquant des quantités égales de véhicule (par exemple, le diméthylsulfoxyde, l’acétonitrile ou eau distillée).Remarque : Il est souvent plus facile d’établir la concentration la plus élevée, soit10-6 M (provenant d’un stock de 10-3 M) et ensuite effectuer des dilutions successives le long d’une échelle logarithmique (par exemple, 10-6–10-10 M). Le volume à préparer dépend du moment de la demande, débit de l’appareil et nombre de bandes à examiner, par exemple, pour une application de 25 min de réactif et un débit de 1 mL/min, un minimum de 25 mL de chacune des concentrations par préparation tissulaire est enquête Ed. Appliquer la première concentration du composé dans le tissu en plaçant le tube d’alimentation pour le bain de tissu dans une bouteille de laboratoire en verre contenant le réactif à la concentration désirée.Remarque : Cela doit se faire lorsqu’on atteint une planification régulière de contractions spontanées ou OT/VP-stimulée. Appliquer la solution de contrôle de véhicule correspondant de la même façon à un second bain. Enregistrer l’heure d’application (c’est-à-dire, lorsque le tube d’alimentation a été changé). Répétez le processus pour chaque concentration en plaçant dans l’ordre la tubulure d’alimentation dans le flacon de laboratoire de verre contenant la concentration suivante dans la série et répétez jusqu’à ce que toutes les concentrations ont été appliquées.L’application de chacune des concentrations peut être comprise entre 15 et 30 min, mais doit être cohérente pour chaque concentration appliqué et entre les expériences. OT ou contraction stimulée par VP tendent à exiger les plus longues périodes d’application (par exemple, 25 min) pour tenir compte de la réduction de la fréquence de contraction observée sous stimulation. Des expériences préliminaires pour déterminer l’heure optimale d’application doivent être effectuées au préalable avec n’importe quel nouveau réactif à l’essai. Retourner le tube d’alimentation PSS (avec ou sans OT/VP) au lavage. Cliquez sur « arrêter » pour mettre fin à l’enregistrement en direct. Immédiatement enregistrer les données dans un dossier approprié et exporter une version sous forme de fichier « .mat ». 7. analyse de données Remarque : La capture de données et l’analyse peut être effectuée par n’importe quel nombre de paquets de logiciels acquisition données disponibles dans le commerce. Voir Table des matières pour plus de détails des logiciels utilisés dans le présent protocole. Pour une évaluation précise de l’activité contractile, les paramètres des contractions à mesurer comprennent : i) l’amplitude de la contraction, ii) fréquence de contraction, iii) durée de contraction et force iv) moyenne intégrale (Figure 4). Force moyenne intégrale est l’équivalent de la surface sous la courbe de contraction et est donc un indice du travail total effectué par la bande de tissu dans un temps donné. Certains ou tous les paramètres peuvent être analysés. Au minimum, il est recommandé que la force intégrante moyenne et l’amplitude de la contraction sont analysées53. Dans les expériences décrites ici, nous avons mesuré les variations dans l’amplitude de la contraction et l’aire sous la courbe. Importer un fichier the.mat dans le logiciel d’analyse. Ajuster la colonne correspondant à l’axe des X pour refléter l’heure expérimentale, compte tenu de la fréquence d’intervalle d’échantillonnage. Des expériences sont généralement enregistrés à 10 Hz correspondant à 10 échantillons/s ou 600 échantillons/min. Tracer les données sous forme d’un graphique de coordonner de X-Y à l’aide « Plot | Fonction de la ligne ». Zéro de la ligne de base de la contraction à l’aide de la fonction « traduire verticale » sur le logiciel. Sélectionner une période de contrôle approprié.NOTE : Ceci est la période qui précède immédiatement l’application de la première concentration de régent mais égale à la durée d’application du réactif (Figure 4 a). Par exemple, si l’application du médicament X est pour 25 min, utiliser les 25 min précédant la première demande du médicament X comme contrôle. Lue pour l’axe des Y, enregistre l’amplitude (force) de contraction au pic maximum de chaque contraction survenant pendant la période sélectionnée et on calcule une valeur moyenne. Mesurer la durée de la contraction à 50 % de cette valeur de crête de lecture hors de l’axe des X en début et en fin de chaque contraction et d’enregistrer une valeur moyenne. Compter le nombre de contractions qui se produisent dans le laps de temps pour générer une valeur pour la fréquence. Utilisez la fonction de « l’intégration » pour calculer des AUC (en unités arbitraires, a.u.) pour la période de temps sélectionnée.Remarque : Pour enregistrer avec précision les AUC, il est essentiel que la ligne de base des contractions est fixé à zéro sur l’axe Y. Séquentiellement, se déplacer dans chacune des concentrations et enregistre les paramètres différents de la contraction. Définissez les données de contrôle à 100 % et expriment les valeurs obtenues en vertu de chaque concentration du réactif sous forme de pourcentage de ce contrôlent c’est-à-dire, valeurs pour la stimulation doivent être > 100 % alors que la détente doit être < 100 %.NOTE : Normaliser les données de cette façon devrait permettre à l’utilisateur de comparer les résultats entre les bandes et des traitements pharmacologiques. Répétez pour chaque expérience et transférer les données d’un package graphique.

Representative Results

En utilisant ce modèle, la réponse aux divers agonistes et antagonistes de la contraction, ainsi que nouveaux agents de la fonction connue ou inconnue peut être examinée et quantifiée. Les paramètres pharmacologiques standards tels que les EC50 et IC50 valeurs peuvent être calculées lorsque les réactifs sont utilisés dans un large éventail de concentrations, par exemple, 10-5-10-9 M et ajoutés à l’augmentation des concentrations le long une échelle logarithmique. L’ocytocine récepteur antagoniste Concentration-réponse expériencesDans cette expérience, bandes appariées de myomètre humain ont été coupés comme décrit ci-dessus et illustrés à la Figure 1, monté dans les bains de tissus, comme illustré à la Figure 2et a permis de s’équilibrer pour produire des contractions stables d’égale amplitude et fréquence. Bandes ont été ensuite exposés à l’agoniste endogène d’OTR, OT (0,5 nM) pour stimuler les contractions. Après une période d’activité stable sous OT (en général 45 min), atosiban a été appliqué à une bande en augmentant les concentrations le long d’une échelle logarithmique (10-9-10-6 M). La deuxième bande a été laissée en OT seul sous le contrôle de temps. Un exemple de la réponse à atosiban peut être vu dans la Figure 5 a. Prendre les contractions qui précède immédiatement la première concentration d’atosiban comme contrôle (100 %), l’amplitude et l’AUC pour chaque concentration appliquée a été calculé, comme illustré à la Figure 4. Pour des expériences de contrôle horaire, l’heure-équivalente à des manœuvres expérimentales a été mesurée. Les données sont ensuite tracées et les courbes ajustées à l’aide de la fonction de régression non linéaire dans un logiciel graphique (Figure 5 b-C). En ce qui concerne le calcul de l’effet inhibiteur, la puissance relative de l’atosiban a été calculée en mesurant la ci50 qui est la réponse inhibitrice concentration provoque la moitié maximale (50 %). Peut être faire de même pour les agonistes ou stimulateurs de la contraction. Dans ce cas la puissance du composé est calculée à partir du EC50 (la concentration provoquant demi réponse de stimulation maximale). Enquête sur la réponse de nouveaux composés et tester leur sélectivité du récepteurNous avons utilisé ce modèle physiologiquement pertinent de l’ex vivo des contractions myométriales humaine pour étudier les effets antagonistes d’un composé nouvellement synthétisé, [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) sur les contractions stimulées avec soit la native V1 a R agoniste, VP ou l’agoniste natif d’OTR, OT. Ce test nous permettant de valider la sélectivité du récepteur de INT [D-Arg8], qui avait été précédemment établie par des méthodes pharmacologiques sur les cellules à un antagoniste à le V1 aR mais non à l’ OTR54. Dans cette expérience, bandes myométriales humains ont été exposés à 0,5 nM VP ou 0,5 nM OT pendant environ 1 h pour stimuler les contractions, comme illustré à la Figure 3, avant d’ajouter notre nouvelle INT composé de [D-Arg8] dans l’augmentation des concentrations (Figure 6 a et Figure 6C). il a ensuite été comparé à le disponible dans le commerce, connu V1 aR antagoniste, SR49059 (Figure 6 b). Figure 6 a illustre la concentration diminue dépendante des contractions myométriales humain stimulée par VP avec augmentation des concentrations de [D-Arg8] INT. Les données pour l’amplitude de la contraction et l’AUC pour chaque concentration sont résumées dans la Figure 6Aii-iii. L’effet est similaire à celle montrée à l’augmentation des concentrations de l’inhibiteur bien connu V1 aR, SR49059, illustré à la Figure 6Bi-iii. La sélectivité de [D-Arg8] INT vers le V1 aR mais pas vers l’OTR est démontrée par le fait que [D-Arg8] INT ne fait pas des contractions myométriales humaine diminution qui ont été stimulées par l’OT (Figure 6) comme amplitude et AUC est demeuré stable (Figure 6Cii-iii). Figure 1 : dissection de biopsie humaine myométriales. (A) A schéma de l’utérus humain montrant les trois tissus des couches qui composent la paroi utérine. La couche la plus profonde est l’endomètre (decidua en flèche de la grossesse, rouge), la couche intermédiaire est le myomètre (flèche de la couche musculaire, noir) qui génère des contractions et la couche la plus externe est la perimetrium (ou membrane séreuse, flèche bleue) qui constitue une couche protectrice autour de l’utérus. La région d’intérêt pour l’échantillonnage de biopsie est représentée par le rectangle noir. Une biopsie de l’exemple d’une femme enceinte prélevée par césarienne est représentée en (B) avec la caduque et myométriales couches en surbrillance (séreuse non visible). Il est essentiel que les couches de tissus différents sont identifiés pour que les bandes de myomètre sont disséqués correctement pour l’expérimentation. Une bande d’exemple du myomètre qui a été disséqué et découpé est montrée en (C). En général, les bandes de 2 à 6 sont coupés et découpés comme indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : multi-organes bain ensemble expérimental vers le haut servant à mesurer les contractions du myomètre humain. (A) bandes de myomètre sont placés dans l’orgue de petite (1 mL) bain chambres placés au dessus d’un réservoir chauffé (i) et sont superfusés avec une solution saline physiologique (PSS) au moyen d’une pompe péristaltique (ii). Le réservoir est maintenu à une température réglée au moyen d’un bain d’eau circulante (iii). Chaque bande est attaché à un capteur de force (iv), qui enregistre les changements de tension lors de la contraction. Ceci est amplifié par un amplificateur transbridge (v) et converti en un signal numérique (vi), qui est enregistré sur un système informatique (vii) exécutant le logiciel d’acquisition connexes. (B) image agrandie d’une chambre de bain d’orgue avec une bande de myomètre humain in situ (flèche rouge), baigné de PSS avec une extrémité attachée à un capteur de force et l’autre à un crochet fixe. ()C) aperçu schématique de la mise en place. Chambres de tissus remplis de PSS sont continuellement perfusés avec PSS chauffée à 37 ° C qui se fait par échange de chaleur avec un réservoir d’eau chauffée sous les bains (maintenues à 45 ° C) et une pompe de circulation eau à 55 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : contractions spontanées et stimulée par l’agoniste du myomètre humain in vitro. Dans des conditions exemptes d’agoniste, contractions spontanées restent stables pendant plus de 3 h d’enregistrement sans perte significative de l’amplitude ou zone-sous la courbe (AUC)Aii( Aiii) démontrant la robustesse de ce modèle pour étudier la application de divers agents sur la contraction spontanée. Après avoir établi les contractions stables, spontanées, 0,5 ocytocine nM (B, OT) ou vasopressine (C, VP) a été ajouté à la solution de sérum physiologique (PSS). En vertu de la stimulation des contractions aussi restent stables pendant quelques heures, sans perte significative de l’amplitude de la contraction (Bii, Cii) ou AUC (Biii, Ciii) permettant l’effet de divers agents contractiles d’être objet d’une enquête en présence du myomètre agonistes. Les données sont présentées comme moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM). Remarque, pour les contractions stimulée par l’agoniste (B, C), la période de contrôle (100 %) est prise après les premières 45 min d’application de l’agoniste, une fois que les contractions se sont stabilisées. Dans tous les cas, les bandes ont été perfusés avec PSS à 37 ° C, pH 7,4 (reproduit de Arrowsmith et al. 40 avec la permission de Sciences de la reproduction et Di Giglio et al. 54 avec la permission de Rapports scientifiques sous licence Creative Common Open Access). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : analyse des données. (A) Une période de contrôle approprié en rouge a été déterminée en sélectionnant les contractions précédant immédiatement la demande de la substance d’essai (médicament X). Cette période de contrôle est aussi égale à temps pour l’application du médicament X (par exemple, 40 min dans cet exemple). Une fois mesurées les valeurs pour la période de contrôle sont définies comme 100 %. Toutes les mesures ultérieures sont alors exprimées en pourcentage de contrôle. (B) il y a 4 différents paramètres de contraction qui peut être mesurée : (i) l’amplitude de la contraction qui mesure la force de contraction (force, mN), (ii) la fréquence de contraction qui mesure la vitesse de contraction, (iii) durée de la contraction qui est mesurée à demi pointe maximale de contraction et (iv) la surface sous la courbe (également connu sous le nom intégral, arbitraire unités de la force) qui donne une mesure de l’ensemble du travail accompli. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : enregistrement de l’effet antagoniste de l’atosiban sur les contractions induites par l’ocytocine dans le myomètre humain. Une fois que les contractions spontanées ont été établies, les contractions ont été stimulées avec l’agoniste de récepteur de l’ocytocine, l’ocytocine (OT). Les contractions ont été autorisées à se stabiliser sous stimulation pour un encore 45 min. (A) The V1 a et un antagoniste des récepteurs de OT, l’atosiban a ensuite été appliqué dans l’augmentation des concentrations le long d’une échelle logarithmique (10-9-10-5M). Les contractions pendant la période précédant la première concentration d’atosiban ont été mesurées et prises comme contrôle (100 %). L’activité au titre de chaque concentration ultérieure a été mesurée et exprimée en pourcentage de contrôle. Le même a été réalisé pour bandes exposés à OT seul à l’aide de l’équivalent-temps de manoeuvres expérimentales. Données ont été tracées dans le logiciel graphique : (B, C) montrent les courbes concentration-réponse pour l’effet antagoniste de l’atosiban (bleu) et dilution du véhicule (gris, contrôle horaire) a lieu sur l’amplitude de la contraction induite par l’OT myométriale et aire sous la courbe (AUC), respectivement. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart du pourcentage de la moyenne (SEM) d’amplitude et de l’ASC de l’activité de contrôle (avant l’application de l’atosiban). IC50 valeurs ont été calculées puis qui donnent à la concentration à laquelle la réponse de (50 %) moitié inhibitrice maximale pour l’amplitude de la contraction et la force integral (AUC) est atteint (reproduit de Arrowsmith et al. 40 avec la permission de Sciences de la reproduction). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : test de la sélectivité effet et récepteurs d’un roman composé sur la contraction du myomètre humain. Après que des contractions spontanées du myomètre humain ont été établies, les contractions ont été stimulées avec agoniste des récepteurs de la vasopressine, la vasopressine (VP) (Ai, Bi) ou l’agoniste de récepteur de l’ocytocine, l’ocytocine (OT) (Ci). L’effet de [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) et l’antagoniste de1 aR V disponible dans le commerce, SR49059 sur les contractions stimulées par VP a été évalué en appliquant des concentrations croissantes des composés. Les réponses typiques sont présentés dans (Ai, Bi). Les associés ont analysé les données d’amplitude et l’aire sous la courbe (ASC) sont indiquées au point (ii) et (iii), respectivement où l’effet a été exprimé en pourcentage de contrôle de l’activité (100 %). [D-Arg8] INT tant l’antagoniste de1 aR V connu, SR49059 a entraîné une diminution dépendante dose amplitude et AUC, appuyant le rôle de [D-Arg8] INT comme un antagoniste des récepteurs1 aR V dans le myomètre humain. En revanche, INT [D-Arg8] n’a pas affecté les contractions stimulées par l’OT (Ci-iii), donc de la même façon à nos constatations des essais sur des cellules de base, [D-Arg8] INT montre également la sélectivité à le V1 aR dans le myomètre humain (données reproduites de Di Giglio et al. 54 avec la permission de Rapports scientifiques sous licence Creative Common Open Access). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Bien que le développement de médicaments plus est destiné pour le traitement des maladies humaines, la recherche plus fondamentale est principalement réalisée dans les tissus animaux. Nous décrivons ici les méthodes pour étudier ex vivo des contractions du myomètre humain provenant de la chirurgie qui peut être utilisée pour traiter un certain nombre de questions importantes liées à l’utérus physiologie et pathologie, ainsi que pour valider les réponses fonctionnelles aux connus et nouveaux agents pharmacologiques pour faciliter le développement de médicaments. En particulier, nous mettons en évidence l’utilisation de ce test visant à déterminer les antagonistes d’un connu OTR et V1 aR antagoniste compétitif, atosiban sur les contractions myométriales enceinte OT-induite, ainsi que pour déterminer la réponse et du récepteur sélectivité d’un nouvellement mis au point V1 aR antagoniste, [D-Arg8] INT. Nous démontrons que les paramètres pharmacocinétiques importants tels que les EC50 et IC50 peuvent être calculées, qui cadrent bien avec les données de pharmacologie cellulaire.

L’utilisation simultanée de plusieurs bandes permet une comparaison directe des multiples effets agent, expériences de compétition avec les antagonistes et des contrôles appropriés de temps et le véhicule. Comme les bandes sont souvent préparés en groupes de 2, 4 ou 8, cette technique offre un débit modéré, permettant le contrôle des composés 2 – 4 à 6 – 8 (cumulatives) concentrations (par biopsie). Cette méthode fournit également des données en temps réel afin que les effets peuvent être évalués rapidement et de protocoles peuvent être ajustées. En outre, cette technique peut servir à tester n’importe quel composé d’intérêt et a été utilisée avec succès par un certain nombre de groupes de recherche ont porté sur myométriales physiologie et à la découverte de médicaments. En plus de l’analyse des composés purs comme décrit dans cet article, le modèle de la contractilité utérine a été également et peut être utilisé avec succès pour dépister les utérotoniques nouveaux composés de mélanges, tels que les préparations à base de plantes de la médecine traditionnelle7 , 55 , 56.

Bien que ce modèle soit techniquement robuste et montre la bonne reproductibilité, il possède quelques limitations : Dissection peut être difficile pour ceux qui connaissent les tissus ou à l’aide de matériel de dissection, donc nouveaux utilisateurs nécessiteront peu de temps pour optimiser les tissus préparation et protocoles. Il convient également de noter que myomètre humain diffère considérablement en apparence à d’autres modèles tels que le rat et la souris. La plupart l’utérus rongeurs sont composées de deux cornes utérines tubulaires, chacun doté d’un ovaire à une extrémité et rejoint le col de l’utérus. Chaque corne a clairement défini les couches de muscles longitudinaux et circulaires, qui peuvent être facilement séparés à dissection, tandis que les types de fibres différentes dans le myomètre humain sont souvent enchevêtrés formant un « maillage ». En outre, les profils de contraction du myomètre humain sont très différentes de rongeurs. Plus particulièrement, les contractions dans le myomètre humain sont moins fréquentes mais plus long dans la durée. Expérimentale des délais pour travailler avec le myomètre humain sont donc souvent beaucoup plus longtemps que les modèles de rongeurs. Différences dans l’expression des récepteurs entre espèces peuvent aussi contribuer à des différences assez marquées dans les réponses aux agonistes et nous devrions garder à l’esprit si extrapolation des résultats à travers les espèces.

Il y a aussi nombre d’étapes nécessitant un examen afin de maximiser le rendement de ce système. Étapes critiques incluent la préservation de la viabilité des tissus tels que prendre soin lors de la manipulation des tissus pour éviter les dégâts inutiles au cours de la dissection ou lors du montage. Il faut un œil habile à disséquer les fines lamelles de muscle utérin, assurant que l’orientation des fibres musculaires est dans le sens longitudinal et suivant le plan du tissu, ainsi évitant les tissus cicatriciels, caduque et petits vaisseaux. Pour fins d’orientation à l’aide une fois l’échantillon au laboratoire, il est possible d’ajouter une balise (par exemple, petit point chirurgical) au moment de la collecte d’un côté de la biopsie pour délimiter le bord séreux du bord déciduale.

Tissus convient à un 36-37 ° C constant au cours de l’expérimentation comme fonction de tissu est soumis à des fluctuations de température. Ceci peut être réalisé avec un climatiseur robuste au sein du laboratoire. La perfusion constante du PSS chauffée assure que la température est maintenue ainsi que la chasse d’eau des déchets produits par la contraction. Température à l’intérieur des thermes d’orgue peut être modifiée en changeant de débit ou de réglage de la température de l’eau du bain directement. La taille de petit bain par rapport aux bains traditionnels 5-50 mL assure une rotation relativement rapide des PSS et l’affouillement des réactifs. La préparation miniaturisés comme décrit ici, réduit également le volume de SSV et réactifs d’intérêt nécessaire, réduisant ainsi les coûts et épargnant précieux, nouvellement mis au point des produits chimiques. En outre, en raison de la taille du petit bain et en utilisant un tampon HEPES, ce système ne nécessite pas par exemplel’oxygénation, de bouillonnement le PSS avec carbogen. Normalisation de la tension appliquée aux bandes est également importante. Pour bandes de cette taille (5 x 2 x 1 mm), cela devrait être environ de 2 mN (équivalent à ~0.2 g). Méthodes alternatives comprennent l’application d’une solution à forte concentration de potassium pour provoquer la contraction maximale et qui s’étend jusqu’à la moitié de cette contraction maximale. Il convient de noter toutefois, que cette tension appliquée en vivo peuvent différer.

Les principaux défis incluent obtenir des tissus des sujets humains, mais bien que le taxage, tissus humains représentent clairement le plus physiologiquement pertinent (et enrichissante) modèle pour l’étude des contractions utérines en humaine maladie et découverte de médicaments. Les tissus isolés bandes Toutefois, ne pas nécessairement synonymes de tissu in vivo car elles sont exemptées par exemple, de hormonal et nerveux d’entrée qui, bien que non essentiel pour la contraction, vont moduler les contractions in vivo. Ce test offre cependant la possibilité d’analyser les contractions myométriales de façon contrôlée, séparée de ces influences. Il permet également l’effet de facteurs tels que le contrôle hormonal de la contraction (par exemple, via OT, VP, prostaglandines, etc.) pour être l’objet d’une enquête, fournissant des indices sur la régulation de la fonction myométriales. Comme les tissus proviennent de différentes femmes, il y a naturellement quelques variations dans les profils contractiles spontanées entre les échantillons. C’est pourquoi il est souvent nécessaire de réaliser des expériences sur un grand nombre (~ n = 10) des échantillons afin de minimiser la variation de certains ensembles de données53. C’est plus important lorsque l’on compare l’activité contractile entre divers groupes de patients. Normaliser la réponse des agonistes et des antagonistes pour contrôler l’activité (p. ex., exprimé en pourcentage de l’activité de contrôle ou élevé K+) réduit une partie de cette variation. En outre, pour réduire la variation inter-bande, les données peuvent être normalisées pour enlever la section transversale en mesurant leur longueur et le poids après expérimentation41. Ceci est particulièrement utile lorsque l’on compare les modes de contraction entre divers groupes de patients.

Limites de cette technique également incluent l’accès aux tissus frais nécessitant de bonnes relations de travail avec le personnel de l’hôpital, en particulier le personnel théâtre et ceux impliqués dans le processus de consentement. Des autorisations éthiques de la Commission d’examen Research Ethics Committee et Institut ou un hôpital locale doivent également être en place. Collection de myomètre humain est probablement effectué lors de l’accouchement de CS, lorsque le donateur est devant subir une chirurgie. La biopsie est prise au même endroit de l’incision utérine pour livrer le bébé, et c’est pourquoi le patient n’a pas besoin de subir des procédures supplémentaires supplémentaires. Personnel du théâtre et le chirurgien à effectuer la biopsie doivent être mis au courant de l’utilisation subséquente des tissus, et qu’ils ne doivent ne pas être placées en solutions fixateur exemple en ce qui concerne l’envoi d’un département de pathologie. Le calendrier longtemps expérimental est une autre considération. Expériences avec les tissus humains prennent plusieurs heures (généralement > 6 h) (au lieu de 2 à 3 h pour une expérience similaire dans l’utérus de rat ou de souris), en raison de la fréquence plus lente de la contraction et le temps de latence de 2 – 3 h entre montage de tissus et création de spontané contractions. Toutefois, comme nous l’avons montré, les contractions de tissus humains sont robustes et lorsque établies peuvent contracter pendant de longues heures sans fatigue importante40.

Ce système permet également d’autres défis en vivo devis à surmonter notamment la possibilité de tester les réactifs pharmaceutiques sur soie enceinte. Cette technique sont facilement extrapolables à d’autres espèces, y compris la souris selon laquelle les premiers résultats peuvent être confirmées avant de continuer plus loin dans les études chez l’animal entier. Contrôlé des changements de température, composition de la préparation (PSS) et le pH peut se faire facilement de simuler différents scénarios en vivo et d’analyser l’effet de ces changements sur le comportement des composés. Les principes de base de mesure de tension isométrique en bandes myométriales peuvent aussi être étendus à la mesure des changements simultanés de pH ou de la concentration intracellulaire en calcium par l’utilisation des Ca fluorescent ou indicateurs de pH (H+) et équipements pour détecter et record de fluorescence57,58,,du5960.

Dans l’ensemble, le myomètre humain représente un modèle robuste et physiologiquement pertinent pour caractériser et valider de nouveaux composés thérapeutiques dans la découverte de médicaments — les deux composés purs et des mélanges. Nous avons donné des exemples de son utilisation dans la découverte de médicaments en ce qui concerne le système OT/VP et axée surunR antagonistes OTR et V1 pour montrer comment ce modèle peut être utilisé pour déterminer composée efficacité et puissance sur des cibles déterminées et valider la sélectivité du ligand. Cependant, il faut avoir à l’esprit que cette technique peut être utilisé pour étudier n’importe quelle cible d’intérêt ou de la voie conduisant à la contraction du myomètre (ou détente), ainsi que pour faciliter la découverte de nouvelles cibles et des chemins et faire avancer notre compréhension du myomètre physiologie et physiopathologie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par le fonds autrichien de Science (FWF) par le biais de projet I3243 et le Conseil européen de la recherche (CER) au titre de la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et le programme pour l’innovation (Convention No 714366 de subvention). GTC a été soutenu par une bourse de futur de l’Australian Research Council (ARC) (FT140100730) et MM par une bourse de chercheur de carrière début ARC découverte (DECRA) (DE150100784). SA est supporté par une Harris-bien-être prématuré naissance Centre de subvention de recherche administré par Wellbeing of Women, UK.

Materials

Origin software Origin Lab 2015 version
Labscribe Software WPI Formally Datatrax
GraphPad Prism graphical software GraphPad Prism PRISM 5
LabTrax 4-Channel Data Acquisition WPI LAB-TRAX-4
Transbridge Transducer Amplifier WPI SYS-TBM4M
Force-displacement Transducer WPI FORT10g 10 g
BNC to BNC Cable WPI 500184
Magnetic Clamp stand WPI M10
Micrometer Reconditioned from microscopes
Peristaltic pump Gilson MINIPULS3 R4 Standard pump head
Suction pumps Various AP2 air pump
Circulating Water bath Grant Instruments TC120 5L
Perspex Tissue Bath Custom made
Water reservoir container the reallyusefulbox 7L
Tissue Hooks (fixed) Hand made in house
Peristaltic tubing Gilson F117948 PVC 2.79 mm internal diameter
Tygon Tubing Fisher Scientific various diameters R-3603
Aluminium clips Laser services, USA custom made
Stereo Zoom binocular microscope WPI PZMIV
Microscope Fiber-optic Light Source WPI PHOTONIC PL 2000
Dissecting Dishes Handmade with Sylgard
Sylgard Silicone Elastomer kit Dow Corning Sylgard 170 Kit
Vannas Scissors WPI 50086 8.5 cm, straight edge
Iris Forceps WPI 15914 10 cm, straight edge (serrated)
Dissecting scissors WPI 14393 10 cm, straight
Dissecting pins SIGMA Z192341 B-D precision guide syringe needle 30G
HBSS SIGMA H9269
Physiological Salt Solution SIGMA various PSS
Oxytocin acetate salt SIGMA O6379
[Arg8]-vasopressin acetate salt SIGMA V9879
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Arrowsmith, S., Keov, P., Muttenthaler, M., Gruber, C. W. Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development. J. Vis. Exp. (131), e56639, doi:10.3791/56639 (2018).
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