人子宫平滑肌的收缩力测量对药物开发的帮助

在与人体组织合作之前, 必须建立适当的机构、伦理审查委员会和人体组织实验的安全批准。本文所述的所有工作都获得了当地研究伦理委员会 (利物浦东部, REC 参考 10/H1002/49) 和研究开发部, 利物浦妇女医院和利物浦大学的机构审查理事会的批准。 注: 本议定书中所描述的所有活检都是从在利物浦妇女医院接受产前择期 CS 分娩的妇女获得的, 每个女性都给予书面知情同意参加。 1. 解决方案 制备改良的克雷布斯生理盐水溶液 (PSS), 其成分如下: 154 毫米氯化钠, 5.6 毫米氯化钾, 1.2 毫米 MgSO4, 7.8 毫米葡萄糖, 10.9 毫米 HEPES, 和 2.0 mm CaCl2。注: 所制作的容积是根据操作中的组织浴数、系统的流速 (1 毫升/分) 和估计的试验长度 (包括平衡和冲洗时间) 确定的。 使用4米氢氧化钠调整 pH 值至7.4。 2. 组织浴设置 用55-60 ° c 的循环水浴将组织浴系统的储层预热到 ~ 45 ° c。注: 该装置底座上的蓄水池加热至45° c, 在允许与流经的蠕动油管中的 pss 进行热交换后, 确保组织浴中的 pss 处于37° c。为了确保组织浴中的 PSS 温度达到37° c, 可能需要对设定的温度进行一些调整。这将取决于所使用的仪器和设置流速。 手动开关任何其他必要的设备, 包括放大器, 数据采集和记录系统, 和吸水泵。 在蠕动泵头的滚筒周围放置每个蠕动进给管 (每槽一管)。安全与固定停止和收紧压缩凸轮和锁定键周围的管。将蠕动进给管的自由端插入 pss 的 1 L 容器中, 启动泵, 使 pss 持续灌注到组织浴池中。 确保吸入泵运转正常, 溶液在浴缸中的水平是恒定的, 从而使流量进入浴缸等于去除率。组织浴中的 PSS 水平可以通过使用建模者的粘土在浴缸中操纵吸入管的深度来调节。 通过将已知重量 (相当于 1 millinewton (mN, 力单位)) 放到传感器钩上并记录采集软件检测到的偏转, 来校准力传感器。注意: 可以在软件中调整值, 使记录的值自动转换为 mN, 而不需要在分析过程中进行任何进一步的转换。在组织安装前必须对力传感器进行校准。 3. 组织准备和剥离 在婴儿和胎盘娩出后, 在 CS 上收集妊娠人肌 (1-2 厘米3) 的活检。获得 (典型的) 全厚度活检, 其中两个 perimetrium (子宫外浆膜层) 和蜕膜 (子宫最里层的层) 存在。仅使用层组织 (中央肌肉层)。请参见图 1A-b。 除去 (必要的) 蜕膜和任何附着的胎膜 (如果存在), 因为这些组织是已知的产生物质, 可以改变层收缩力。注: 在手术中, 样品被放入汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 或新鲜的 PSS 和储存在4° c。理想的组织应在12-16 小时内使用, 但研究表明, 在18小时的收集与存储在4° c51的收缩力不损害。在4° c 长时间贮存后, 必须进行适当的控制以确认组织的活力和功能。这里的样本取自下子宫段切口部位的上缘, 而不是从上段。子宫的下部和上部部分已被证明与类似的48收缩, 因此下段活检被认为是上段层活动的良好反映。 准备解剖区域和所需的仪器, 包括: 大解剖剪刀, 小 Vannas 解剖剪刀, 两个解剖钳, 解剖针, 和铝组织夹, 周围的解剖显微镜的固定和变焦放大. 将活检样品放在一个清晰的基于硅橡胶的解剖盘上 (参见材料表), 并仔细定位活检, 使浆膜和蜕膜边缘被识别图 1B。 用别针将活检固定在盘子的底部。确保组织在整个解剖过程中保持与 PSS 的水合作用。 在显微镜光源上手动切换, 并在显微镜下观察10x 放大后的组织, 以确定肌无疤痕组织、浆膜、蜕膜和任何附着的胎儿细胞膜的区域。 使用大解剖剪刀进行钝性解剖, 将两个相邻的组织层分开, 露出两个平面或肌肉。注意: 通常在组织层之间找到一个小口袋来开始分离, 但必须注意避免在活检边缘的小血管, 因为它们可能被误认为是 “口袋”。 在组织的每个角落放置解剖针, 以确保它。检查肌肉的部位, 以平行的纤维运行。注意: 通过组织的小毛细血管灌注的方向可以帮助区域识别。轻拉在组织边缘也可以帮助确定的方向, 纤维的旅行。 切掉的组织〜2毫米宽 x 8 毫米长 x 1 毫米厚沿纵向轴与肌肉纤维的方向对准使用小解剖剪刀。注意: 必须采取的护理, 只有保持组织的初始切边, 以避免损害。 重复这个过程, 解剖出实验所需的条数。 将两端的每一条都钉在一起, 以使其伸直并固定在盘子上, 注意不要过度伸展组织。 在每个末端附上铝组织夹子, 以便他们之间的组织是 ~ 5 毫米长并且仔细地切除任何多余的组织 (图 1C)。 转移到一个干净的盘装满 PSS 准备安装。 4. 在浴池中安装组织 将试纸转移到实验性组织浴池。水平地而不是垂直地安装条带 (如传统的器官浴) (图 2B)。 将每个条带的一端连接到力传感器, 它测量组织的收缩, 另一个在组织腔内的固定钩上。注: 组织浴的容量是〜1毫升, 这是足够大, 以确保在浴缸完全淹没的条。 确保在浴缸的每个钩子底部的小条。 通过双击软件图标打开录制软件。 调整每个频道的录制, 使其在 “通道” 窗口中处于视图中。 通过右键单击 y 轴, 选择 “缩放”, 并分别输入0和10的最小和最大值, 调整 y 轴刻度以读取 0-10 V (相当于 0-10 mN 后校准)。选择 “确定”。对每个通道记录重复此操作。 在软件上按 “记录” 开始实时录制。注意: 如果小条没有固定在每个钩子的底座上, 它们可以在收缩过程中滑动, 这在记录中会出现 “缺口”。设定的张力会改变, 因此收缩后滑动可能会有所不同。 通过手动转动每个传感器上的动, 在每个浴缸中拉伸组织。跟随向上组织运动从基线在屏幕和继续转动动直到基线紧张到达 0.2 g (~ 2 mN)。注: 组织将立即开始放松 (以基线张力下降为例), 通常达到1锰之间的稳定张力。在我们的实验条件下, 这种定义的张力已经被优化为这种尺寸的组织条。如果要使用其他大小的组织, 就必须进行适当的长度-张力关系调查, 以优化所用的静力。 允许组织平衡2小时直到自发收缩。注意: 基线紧张的小海拔通常是观察到的, 并且是组织生存能力的一个很好的指示, 并且它将是收缩的。 5. 用40毫米钾 (高钾+) 挑战组织 如果没有自发的收缩发生后 2 h 的安装, 挑战的小条高钾盐溶液, 其中钾升高到40毫米由 isosmotic 取代氯化钠的氯化钾。对于高 K+, 添加以下内容 (在 mM 中): 119.6 氯化钠、40氯化钾、1.2 MgSO4、7.8 葡萄糖、10.9 HEPES 和 2.0 CaCl2。注: 在光滑的肌肉如肌, 高钾+的应用导致收缩由间接地打开电压操作的钙渠道导致最大的汇集的 Ca2 +入组织细胞。因此, 高 K+可作为测试组织完整性的一般指标的一种措施, 同时也可以实现最大组织响应的度量。 将送纸器管放置在包含带条的浴缸中, 将其挑战为包含高 K+的玻璃实验室瓶, 用于1-2 分钟。 将馈电管送回 PSS 的容器。 在实现对高 K+的响应时, 继续监视该条, 以便进一步1小时。如果没有对高 k+的收缩响应, 或者没有自发活动引起后高 k+响应, 则丢弃该条。注意: 在评估对高 K+的响应之前, 实验者还需要注意进纸器导管中的死亡空间 (解决方案到达组织浴所需的时间)。这可能需要2-3 分钟, 将取决于流量。 为了确保从浴缸和馈线管的高 k+完全冲洗, 这可能会影响随后的演习, 等待, 直到自发的收缩返回到前高 k+的振幅, 然后再继续进行实验。 6. 检测已知和新型化合物对层收缩的影响 注: 测试新药物和试剂对层功能的影响的实验可以在自发 (图 3A) 或激动剂刺激的收缩 (图 3B-c) 上执行。对于激动剂刺激的宫缩, OT 或精氨酸加压素 (VP) 添加到 PSS, 使浓度 0.5 nM, 并在整个实验中使用 (图 3B-C)。OT 的浓度已优化此分析, 因为它提供了在自然的阶段性收缩40,52。激动剂的浓度大于这可能导致长期持久, 持续 (强直) 收缩 (参见 Ref41,44 ), 在这种情况下, 各种药物的作用难以评估, 实验时间框架需要大大扩大, 以适应增加的持续时间单独收缩和减少频率。在这个例子实验中, OT 或 VP 被添加来刺激宫缩, 以使已知的工程机械和 V1aR 拮抗剂, 阿托西班和 SR49059, 或我们的新化合物 [d-Arg8]-inotocin ([d-Arg8] INT) 的对抗性, 可以评估。 在 PSS 中 (有或不含 0.5 nM/VP) 稀释至少 1/1000 稀释剂的浓度, 确保广泛的浓度包括不引起对浓度超过最大值的反应。响应. 准备一组等量的稀释 (如: 如、二甲基亚砜、乙腈或蒸馏水)。注意: 通常最容易准备最高浓度,即, 10-6 m (来自 10-3 m 的股票), 然后沿对数刻度执行串行稀释 (如, 10-610-10 m)。要准备的容量取决于应用的时间、仪器的流速和要检查的条数,例如, 对于25分钟的试剂用量和1毫升/分钟的流速, 每个组织浴的每个浓度的最低25毫升是要求署. 将第一浓度的化合物应用到组织中, 将该组织浴的接驳管放置在一个玻璃实验室瓶中, 该瓶子含有所需浓度的试剂。注意: 一旦达到了自发或 OT/VP 刺激收缩的稳定基线, 就应该这样做。 应用相应的车辆控制解决方案, 以同样的方式进行第二次洗澡。 记录应用程序的时间 (即, 当进纸管更换时)。 重复每个浓度的过程, 依次将进料管放入包含系列中下一浓度的玻璃实验室瓶中, 然后重复, 直到所有浓度都被应用。每个浓度的应用可以是在15和30分钟之间, 但应该是一致的每集中应用和在实验之间。那些涉及 OT 或 VP 刺激的宫缩往往需要更长的应用周期 (例如, 25 分钟), 以减少在刺激下观察到的收缩频率。在测试任何新试剂之前, 应先进行初步实验以确定最佳的应用时间。 将馈电管送回 PSS (带或无 OT/VP) 冲洗。 单击 “停止” 结束实时录制。立即将数据保存到适当的文件夹, 并将版本导出为 “. 席子” 文件。 7. 数据分析 注意: 数据捕获和分析可以通过任意数量的商业上可用的数据采集软件包来完成。有关此协议中使用的软件的详细信息, 请参见材料表。为了准确评估收缩活动, 要测量的收缩参数包括: i) 收缩振幅, ii) 收缩的频率, iii) 收缩的时间, 和 iv) 平均力积分 (图 4)。平均力积分等于收缩曲线下的面积, 因此是组织带在给定时间内完成的总功的一个指标。可以对部分或全部参数进行分析。作为最小值, 建议对收缩的平均积分力和振幅进行分析53。在这里描述的实验中, 我们测量了收缩幅度和曲线面积的变化。 将. 席子文件导入分析软件。 在考虑采样间隔频率的同时, 调整与 X 轴对应的列以反映实验时间。实验通常记录在10赫兹对应10样品/秒或600样品/分钟。 使用 “绘图” 将数据绘制为 x-y 坐标图行 “功能。 在软件上使用 “平移垂直” 功能来零收缩基线。 选择适当的控制期。注: 这是第一次在应用前的时间在摄政, 但等同于试剂的应用期限 (图 4A)。例如, 如果药物 x 的应用是25分钟, 使用的25分钟前第一次应用药物 x 作为对照。 读出 Y 轴, 记录在所选时间段内发生的每个收缩的最大峰值时收缩的振幅 (力), 并计算平均值。 通过在每次收缩的开始和结束处读出 X 轴, 并记录平均值, 来测量这个最大峰值的50% 的收缩时间。 计算在时间范围内发生的收缩次数, 以生成频率值。 使用 “集成” 函数计算选定时间段内的 “任意单位, a.u”。注意: 要准确记录联合自卫队, 必须在 Y 轴上将收缩的基线设置为零。 依次移动每个浓度并记录不同的收缩参数。 将控制数据设置为 100%, 并将每个试剂浓度下获得的值表示为此控件的百分比即, 刺激值应为 > 100%, 而放松应为 < 100%。注意: 以这种方式对数据进行规范化, 将使用户能够比较跨条和药理治疗的结果。 重复每个实验并将数据传输到一个图形包。