脊髓 Cocultures 丘脑-皮质轴突分支和突触形成的可视化研究
Summary
本协议描述了丘脑和大脑皮层脊髓 cocultures 中丘脑-皮质轴突分支和突触形成同时成像的方法。单个丘脑-皮质轴突及其突触前终端的可视化细胞电穿孔技术与 DsRed 和 GFP 标记突触素。
Abstract
轴突分支和突触形成是建立精确神经回路的关键过程。在发育过程中, 感觉丘脑-皮质 (TC) 轴突形成分支和突触在特定层的大脑皮层。尽管轴突分支与突触形成之间存在明显的空间相关性, 但它们之间的因果关系却不甚明了。为了解决这个问题, 我们最近开发了一种方法, 同时成像的分支和突触形成的个别 TC 轴突在脊髓 cocultures。
本协议描述了一种由脊髓共培养和电穿孔组合组成的方法。丘脑和大脑皮层的脊髓 cocultures 促进基因操纵和轴突过程的观察, 保留特征结构如层流结构。用电穿孔技术将两种不同的质粒编码 DsRed 和 EGFP 标记的突触素 (SYP EGFP) 与小数目的丘脑神经元共转染。这种方法使我们能够同时可视化 TC 神经元和它们的突触前点的单个轴突形态。该方法还能够长期观察, 揭示轴突分支与突触形成之间的因果关系。
Introduction
哺乳动物大脑中的丘脑-皮质 (TC) 投射是研究轴突导引和靶向机制的合适系统。在发育过程中, 感觉 TC 轴突生长在皮质板块, 并形成分支和突触在大脑皮层的主要感官区域 IV.1,2中优先。即使在基础连接建立后, 轴突和突触端子也会根据环境变化而重建3,4。然而, 如何动态改变 TC 轴突形态是很不清楚的。其中一个主要原因是缺乏足够的技术来观察单个细胞水平的结构变化。虽然最近的显微学, 如双光子显微学的发展, 允许直接观察活体皮层神经元在体内, 但仍有技术上的限制, 捕获的总体 TC 轨道5,6. 因此,体外方法对 TC 轴突进行实时成像, 将为轴突分支和突触形成的结构分析提供有力的工具。
我们的小组首次建立了具有渗透性膜的静态切片培养方法7。使用这种方法, 鼠皮质切片被共培养的感觉丘脑块, 和叶片特定的 TC 连接概括在这个脊髓 cocultures 7, 8.稀疏标记与荧光蛋白进一步允许我们观察 TC 轴突生长和分支形成9,10,11。最近, 我们开发了一种新的方法, 同时成像分支和突触形成的个别 TC 轴突在脊髓 cocultures12。为了同时可视化 TC 轴突和突触前的地点, DsRed 和 EGFP 标记突触素 (SYP EGFP) 通过电穿孔脊髓共培养与小数目的丘脑神经元联合转染。目前的方法有利于 TC 轴突的形态学分析和长期观察, 可用于显示轴突分支与突触形成之间的因果关系。
Protocol
所有实验都是根据大阪大学动物福利委员会和日本神经科学学会制定的指导方针进行的。 1. 丘脑和大脑皮层的脊髓 cocultures 注: 有关详细过程, 请参阅原始出版物7,8,13。所有程序都应在无菌条件下进行。大 (SD) 大鼠用于神经元培养。 试剂制剂注意:?…
Representative Results
本文的实验目的是揭示 TC 轴突分支与突触形成之间的关系。为了同时可视化突触前的轴突轨迹和位置, 脊髓 cocultures 中的单个或几个丘脑细胞被转染为 SYP EGFP 和 DsRed 使用电穿孔的两种质粒。在文化的第二周中, DsRed (图 3) 清楚地标记了单独区分的 TC 轴突。只有显示 DsRed 和 SYP-EGFP 的轴突被选择观察。标记 TC 轴突侵入皮层切片和形成分支主要在上层, ?…
Discussion
目前的协议也是一个强大的工具来研究发展方面的增长轴突以外的 TC 投影11。例如, 皮质切片培养和电穿孔技术的结合使皮层神经元的单个轴突形态学可视化, 长期观察9,18。
利用目前的协议, 在轴突分支和突触形成中, 有趣基因的作用也可以通过荧光蛋白的共表达和兴趣基因来分析。通常, 当质粒溶液的摩尔比率调?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们还感谢加布里埃尔的手进行批判性阅读。
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
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Cite This Article
Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).