Summary

Visualisation de Thalamocortical Axon Branching et Synapse Formation chez organotypique Cocultures

Published: March 28, 2018
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Summary

Ce protocole décrit une méthode pour l’imagerie simultanée de thalamocortical axon branching et synapse formation dans cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral. Les axones thalamocortical individuels et leurs terminaisons présynaptiques sont visualisés par une technique d’électroporation monocellulaires avec DsRed et synaptophysine GFP-étiquetée.

Abstract

Axon branching et synapse formation sont des processus cruciales pour l’établissement des circuits neuronaux précises. Au cours du développement, axones sensoriels thalamocortical (TC) forment des branches et des synapses dans des calques spécifiques du cortex cérébral. Malgré l’évidente corrélation spatiale entre la formation d’axon branching et synapse, le lien de causalité entre eux est mal compris. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment mis au point une méthode d’imagerie simultanée de ramification et synapse formation des axones TC individuels organotypique cocultures.

Ce protocole décrit une méthode qui consiste en une combinaison d’une co-culture organotypique et électroporation. Cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral facilitent la manipulation génétique et l’observation des processus axonales, préservant les structures caractéristiques telles que la configuration laminaire. Deux plasmides distincts codant DsRed et EGFP-tag synaptophysine (SYP-EGFP) ont été conjointement transfectées dans un petit nombre de neurones thalamiques par une technique d’électroporation. Cette méthode nous a permis de visualiser individuels morphologies axones des neurones de TC et leurs sites présynaptiques simultanément. La méthode a également permis d’observation à long terme, qui a révélé le lien de causalité entre la formation d’axon branching et synapse.

Introduction

La projection de thalamocortical (TC) dans le cerveau des mammifères est un système adéquat d’enquêter sur le guidage axonal et ciblage des mécanismes. Au cours du développement, les axones sensoriels de TC poussent dans la plaque corticale et les branches de la forme et les synapses préférentiellement en couche IV des aires sensorielles primaires dans le cortex cérébral1,2. Même après la mise en place de connexions fondamentales, tonnelles axonales et terminaux synaptiques est remodelés selon les changements environnementaux3,4. Cependant, comment la morphologie axon TC est dynamiquement modifiée est mal comprise. Une des principales raisons est le manque d’une technique adéquate pour observer les changements structurels au niveau unicellulaire. Bien que les développements récents en microscopie, telles que la microscopie biphotonique, ont permis l’observation directe de la vie les neurones corticaux en vivo, il y a des limites encore techniques pour capturer le général TC trajectoires5, 6. par conséquent, méthodes in vitro pour l’imagerie direct des axones TC fournirait des outils puissants pour les analyses structurelles d’axon branching et synapse formation.

Notre groupe pour la première fois mis en place une méthode de culture statique tranche avec membrane perméable7. En utilisant cette méthode, une tranche de cortex de rat a été co-cultivées avec un bloc thalamique sensoriel et connexions TC lamina spécifiques ont été récapitulées dans ce organotypique cocultures7,8. Étiquetage clairsemée avec une protéine fluorescente plus loin nous a permis d’observer la croissance axonale TC et la direction générale de la formation9,10,11. Récemment, nous avons développé une méthode originale pour l’imagerie simultanée de la ramification et la formation des synapses des axones de TC individuels dans l’organotypique cocultures12. Afin de visualiser simultanément les axones de TC et sites présynaptiques, DsRed et EGFP-tag synaptophysine (SYP-EGFP) ont été conjointement transfectées dans un petit nombre de neurones thalamiques par électroporation de la co-culture organotypique. La méthode actuelle facilite l’analyse morphologique des axones de TC et permet l’observation à long terme, qui peut être utilisée pour montrer la relation de causalité entre la formation d’axon branching et synapse.

Protocol

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux lignes directrices établies par les comités de protection animale de l’Université d’Osaka et de la société de Neuroscience du Japon. 1. organotypique cocultures du thalamus et le cortex cérébral Remarque : La procédure détaillée, consultez l’original publications7,8,13. Toutes les procédures doi…

Representative Results

L’expérience décrite ici a pour but de révéler la relation entre TC axon branching et synapse formation. Afin de visualiser simultanément les trajectoires axonales et emplacements des sites présynaptiques, unique ou quelques cellules thalamiques organotypique cocultures ont été transfectées avec deux plasmides codant SYP-EGFP et DsRed utilisant l’électroporation. Au cours de la deuxième semaine de la culture, les axones TC distinguables individuellement étaient clairement …

Discussion

Le protocole actuel est également un outil puissant pour étudier les aspects liés au développement de la croissance des axones autrement que de la projection de TC11. Par exemple, une combinaison de la culture de la tranche corticale et la technique d’électroporation permet de visualiser chaque morphologie axonale des neurones corticaux et à long terme d’observation9,18.

En utilisant le protocole actue…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions également Gabriel Hand lecture critique.

Materials

DMEM/F12 GIBCO 11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS) Nissui 5905
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific SH30396-03 Hyclone
Insulin Sigma I6634
Progesterone Sigma P8783
Hydrocortisone Sigma  H0888
Sodium selenite Wako Pure
Chemical Industries
192-10843
Transferrin  Sigma T1147
Putrescine  Sigma P5780
Glucose Wako
Pure Chemical Industries
16806-25
35 mm petri dishes Falcon 351008
Millicell-CM insert Millipore PICMORG50
100 mm petri dishes BIO-BIK I-90-20 petri dish sterrile
HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Disposable sterile plastic pipettes 202-IS transfer pipets sterile
Glass capillary: OD 1.2 mm Narishige  G-1.2 inner diameter, 1.2 mm
Silver wire: 0.2 and 1 mm  Nilaco AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm)
1 mL syringe Terumo SS-01T
Stimulator  A.M.P.I Master 8
Biphasic isolator  BAK ELECTRONICS BSI-2
Amplifier  A-M Systems Model 1800
Oscilloscope Hitachi VC-6723
Manipulator Narishige SM-15
Micromanipulator Narishige MO-10
Stereomicroscope  Olympus SZ40
Universal stand  Olympus SZ-STU2
Light illumination system  Olympus LG-PS2, LG-DI, HLL301
Electrode puller  Narishige PC-10
Confocal microscope Nikon Digital eclipse C1 laser
x20 objective Nikon ELWD 20x/0.45
Culture chamber Tokai Hit UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microsurgery scissors Natsume  MB-54-1

References

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Cite This Article
Matsumoto, N., Yamamoto, N. Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures. J. Vis. Exp. (133), e56553, doi:10.3791/56553 (2018).

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