Gelijktijdige Mapping en kwantificatie van Ribonucleotides in menselijke mitochondriaal DNA

dit protocol is uiteengezet in Figuur 1 en bevat het isolement van gDNA, spijsvertering met enzymen van de beperking te kunnen kwantificeren van het aantal ribonucleotides, behandeling met alkali om te hydrolyseren de phosphodiester banden van ribonucleotides opgenomen in de gDNA, de fosforylatie van gratis 5´-OH eindigt, ssDNA Afbinding van adapters, tweede onderdeel synthese, en PCR versterking voor sequencing. 1. adapters en Index inleidingen ARC49 verkrijgen, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, adapter en ARC78-ARC107 index inleidingen (Zie tabel 1). Opmerking: Moet Oligonucleotides HPLC gezuiverd. ARC76/77 zijn besteld als duplex. Bereiden 100 µM voorraadoplossingen van elke oligonucleotide in Tris-EDTA (TE) buffer (Zie de Tabel van materialen) en opgeslagen bij -20 ° C. Bereiden 10 µM oplossingen voor ARC67/77 en 2 µM oplossingen voor ARC49 en index inleidingen door verder verdunnen in elutie buffer (EB; Zie de Tabel van de materialen). Winkel bij-20 ° C. 2. Groei en oogst van cellen groeien HeLa cellen in 70 mL Dulbecco ' s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum in een Spinner kolf van 250 mL bij 37 ° C. Het aantal cellen tellen en verzamelen van 5 x 10 6 cellen in een 50 mL-buis, centrifuge voor 5 min. op 200 x g, en verwijder het supernatant. Wassen van de cellen met 20 mL 1 x PBS, centrifuge voor 5 min. op 200 x g, en verwijder het supernatant. Het bevriezen van de pellets op-20 ° C of voortzetten van DNA zuivering. 3. DNA zuivering en kwantificatie gDNA met behulp van fenol-chloroform extractie, zoals hieronder beschreven zuiveren. Resuspendeer de cellen in 2 mL lysis-buffermengsel (Zie de Tabel van materialen) en incubeer gedurende 30 min op 42 ° C op een blok Verwarming. Let op: Lysis buffer bevat gevaarlijke componenten. SDS oplossing is irritant, proteïnase K sensibilisatie, irriterende en giftige. Draag beschermende kleding en handschoenen. Splitsen van het monster in twee buizen van 2 mL en voeg 1 volume (V) van fenol-chloroform-Isoamylalcohol (25:24:1). Let op: Fenol-chloroform-Isoamylalcohol is toxische, mutagene, bijtende en gevaarlijk zijn voor het aquatisch milieu. Gebruiken in een zuurkast, Draag handschoenen en beschermende kleding en negeren in speciale fenol-chloroform afval. Mix door inversie voor 30-60-s en Centrifugeer gedurende 5 min op 15.000 x g bij kamertemperatuur. Opmerking: Geen vortex DNA om te voorkomen dat de invoering van willekeurige strand einden, waarmee de resultaten zou verstoren. De bovenste, waterige fase overbrengen in een nieuwe tube 2 mL en voeg 1 V van fenol-chloroform-Isoamylalcohol (25:24:1). Mix door inversie en Centrifugeer gedurende 5 min bij 15.000 x g bij 4 ° C. Transfer bovenste, waterige fase om een nieuwe 2 mL tube en Voeg 20 µL NaCl (5 M) en 1 V van koude isopropanol. Let op: Isopropanol is ontvlambaar, irriterend en giftig. Opslaan in een geventileerde kabinet, Draag handschoenen en beschermende kleding, en het wegblijven van vlammen. Mix door inversie en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij -20 ° C. Centrifuge voor 20 min op 15.000 x 4 ° C, g en negeren supernatant. Wassen DNA pellet met 200 µL koude 70% ethanol, Centrifugeer gedurende 20 min bij 15.000 x g bij 4 ° C en weggeworpen. Let op: 70% ethanol is brandbaar en irritant. Werkende oplossing bij-20 ° C, anders slaan in geventileerde kabinet, Draag beschermende kleding en handschoenen en bewaart het uit de buurt van vlammen. Droog de pellet DNA bij kamertemperatuur gedurende 20-25 minuten DNA los pellets in 100 µL TE bufferen en bundelen van de monsters in één buis. Kwantificeren DNA-concentratie met behulp van een reagens kwantificatie dsDNA volgens fabrikant ' s-specificaties (Zie de Tabel van de materialen). Opmerking: Gebruik een dsDNA kwantificatie reagens, omdat spectrofotometrische kwantificatie van DNA kan worden beïnvloed door residuele fenol. Winkel DNA bij-20 ° C of HincII behandeling voortzetten. 4. HincII behandeling en alkalische hydrolyse Digest 1 µg van DNA in een reactie mix 5 µL 10 x buffer 3.1, 1 µL (10 U) met HincII en nuclease-vrije H 2 O tot een eindvolume van 50 µL. Opmerking: Om te bereiken optimale omstandigheden voor afbinding, tweede onderdeel synthese en PCR versterking, het kan noodzakelijk zijn verhogen de hoeveelheid invoer DNA als de verwachting is dat het DNA een zeer lage aantal ribonucleotides bevat. Ook kan het nodig zijn input DNA vermindert indien het aantal ribonucleotides zeer hoog is. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. HincII zuiveren DNA behandeld met paramagnetisch kralen. Opmerking: Houd de buis deksels openen in de volgende stappen uit om de pellets niet te verstoren door het openen van de buizen. Toevoegen 1,8 V van paramagnetisch kralen aan elk monster, meng zorgvuldig door pipetteren, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten Een magnetische rack kunt pellet de kralen voor 5 minuten, haal hem eruit en vloeistof wordt weggeworpen. Wassen van de pellet met 150 µL van 70% ethanol (kamertemperatuur) voor ongeveer 30 s dan verwijderen en negeren het supernatant. Wassen de pellet met 200 µL van 70% ethanol (kamertemperatuur) voor ongeveer 30 s dan verwijderen en verwijder het supernatant. Opmerking: Residuele ethanol kan worden verwijderd met een pipet 10 µL. Druppels kunnen worden gesponnen beneden kort tevoren. Droog de monsters bij kamertemperatuur voor ongeveer 15-20 min. Opmerking: De exacte tijd hangt af van de omvang van de kralen en de vorm van de pellet, dus de pellets moeten visueel worden gecontroleerd. Buizen verwijderen uit het magnetische rek en elueer pellet in 45 µL EB, Meng door zorgvuldig pipetteren. Broeden voor 5 min dan pellet de kralen op het magnetische rek en het gebruik van 45 µL van gezuiverde DNA in stap 4.4. Toevoegen 5 µL van KOH (3 M) of KCl (3 M) tot het creëren van een totaal volume van 50 µL DNA. Let op: 3 M KOH-oplossing is corrosief. Draag beschermende kleding en handschoenen. Incubate voor 2 h bij 55 ° C in een kruising oven gevolgd door 5 min op ice. Opmerking: Het wordt aanbevolen voor het uitvoeren van de KOH-behandeling in een oven in plaats van een blok van de verwarming te handhaven van een uniform verwarming van de buis en voorkoming van condensatie op de deksel. Precipiteren DNA door toevoeging van 10 µL Natriumacetaat (3 M, pH = 5.2) en 125 µL koude 100% ethanol. Incubeer op ijs voor 5 min. Let op: 100% ethanol is brandbaar en irritant. Opslaan in een geventileerde kast, dragen van beschermende kleding en handschoenen en blijf uit de buurt van vlammen. GDNA pellet door centrifugatie bij 21.000 x g, 4 ° C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Wassen DNA pellet met 250 µL koude 70% EtOH, centrifugeer bij 21.000 x g, 4 ° C gedurende 5 minuten, en verwijder het supernatant. Opmerking: Als u druppels, de buis kan omlaag worden gesponnen, kort weer en supernatant kan worden verwijderd met een pipet 10 µl. Laat de pellet drogen in een open buis voor ongeveer 5-10 minuten totdat alle zichtbare vloeistof is verdampt. Laat DNA pellet los in 20 µL EB gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. 5. 5´ einde fosforylatie bereiden de reactie mix voor elk monster tevoren tegensisting van 2,5 µL 10 x T4 polynucleotide kinase reactie buffer 1 µL (10 U) 3´-fosfatase-minus T4 polynucleotide kinase en 2.5 µL ATP (10 mM). Transfer 19 µL van elk DNA monster in een nieuwe 200 µL buis en denatureren voor 3 min op 85 ° C in een thermo-cycler. Cool DNA monsters op ijs en 6 µL van reactie mix toevoegen aan elk monster. Incubate reactie mixen bij 37 ° C gedurende 30 minuten en stop de reactie van de monsters bij 65 ° C gedurende 20 min. aan het broeden Zuiveren DNA als beschreven in 4.3, met behulp van 1,8 V van paramagnetisch parels maar Elueer in 14 µL EB. 6. afbinding ssDNA de reactie mix voorbereiden in elk monster vooraf bestaande uit 0,5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligase reactie buffer, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µL ARC140 (100 µM), en 25 µL 50% PEG 8000. Meng goed door pipetteren. Let op: CoCl 3 (NH 3) 6 is kankerverwekkend, sensibilisatie en gevaarlijk zijn voor het aquatisch milieu. Draag beschermende kleding en handschoenen. Transfer 13 µL van gezuiverde DNA van 5.5 stap naar een nieuwe 200 µL buis en denatureren voor 3 min op 85 ° C in een thermo-cycler. Cool het DNA op ijs en voeg 36 µL van reactie mix aan elk monster, Meng door pipetteren, en spin down kort. Voeg 1 µL (10 U) van T4 RNA Ligase naar elke reactie, Meng door pipetteren, en spin down kort. De monsters bij kamertemperatuur incuberen in de donkere overnachting. 7. Tweede-onderdeel synthese zuiveren afgebonden DNA zoals beschreven in 4.3, maar gebruik van 0,8 V van paramagnetisch kralen, pellet de kralen voor 10 min en elueer in 20 µL EB. Opmerking: Als gevolg van de hogere viscositeit van de afbinding reactie mix, is de eerste stap van de pelleting verlengd. Transfer 20 µL van DNA-monster tot een nieuwe 200 µL PCR koker. Herhaal de stap van de zuivering met behulp van 0,8 V van paramagnetisch kralen na de fabrikant ' s specificaties en elueer in 14 µL EB. De reactie mix voorbereiden op elk monster vooraf bestaande uit 2 µL van 10 x T7 polymerase van DNA reactie buffer, 2 µL ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTPs (2 mM) en 0.8 µL BSA (1 mg/mL). Transfer 12,8 µL gezuiverd DNA tot een nieuwe 200 µL buis, denatureren voor 3 min op 85 ° C in een thermo-cycler. Afkoelen van het DNA op ijs en 6.8 µL van reactie mix aan elk monster, Meng door pipetteren spin down kort en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur toevoegen. 0.4 µL (4 U) T7 DNA polymerase toevoegen aan elke reactie en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuiveren DNA als beschreven in 4.3, met behulp van 0,8 V van paramagnetisch kralen en elueer in 11 µL EB. 8. PCR versterking en bibliotheek Quantitation voorbereiden de reactie mix voor elk monster in een nieuwe 200 µL buis vooraf bestaande uit 7,5 µL ARC49 (2 µM), 7,5 µL index primer (2 µM, uniek voor elk monster) en 25 µL 2 x warme start klaar mix. Voeg toe 10 µL van DNA-monster naar elke reactie. Versterken van de bibliotheek met behulp van de volgende voorwaarden: denatureren bij 95 ° C gedurende 45 s, gevolgd door 18 cycli van 98 ° C voor 15 s, 65 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s, eindigend met een definitieve rek bij 72 ° C gedurende 2 min. Hold monsters op 4 ° C na versterking. Zuiveren van Bibliotheken, zoals beschreven in 4.3, met behulp van 0,8 V van paramagnetisch kralen, en elueer in 20 µL TE buffer. Kwantificeren van bibliotheken met behulp van een reagens dsDNA kwantificatie, volgens de fabrikant ' s-specificaties (Zie de Tabel van de materialen). Opslaan van monsters bij-20 ° C of bibliotheek analyse voortzetten. 9. Bibliotheek analyse en samenbrengen bepalen de kwaliteit van elke bibliotheek en de raming van de omvang van de gemiddelde fragment met behulp van een systeem van digitale elektroforese. Opmerking: De gemiddelde fragment grootte wordt beoordeeld door te schatten waar het oppervlak onder de kromme van de electropherogram is gehalveerd, rekening te houden met pieken van markeringen. Representatieve resultaten van geschikte bibliotheek profiles na KOH of KCl behandeling worden gegeven in figuur 2A. Bereken de concentratie (nM) van de bibliotheken als: (c/10 3) /(p*650)] * 10 9 waar c is de concentratie van de bibliotheek in ng/µL is en p de grootte van de gemiddelde fragment in bp, als geraamd in 9.1. Pool gelijke molaire hoeveelheden van maximaal 24 bibliotheken versterkt met andere index inleidingen voor het rangschikken. Toevoegen TE buffer tot een eindvolume van 25 µL en concentratie van 10 nM. Opmerking: Afhankelijk van het aantal bibliotheken om te worden samengevoegd, is het bedrag van DNA uit elke bibliotheek aangepast. Als inleidingsdimeer zijn aangetroffen in stap 9.1 als een duidelijke piek van ongeveer 130 bp, het eindvolume van het zwembad van de bibliotheek kan groter zijn dan 25 µL, omdat de zuivering wordt herhaald, zoals beschreven in 4.3, met behulp van 0,8 V van paramagnetisch kralen, en DNA wordt geëlueerd in 25 µL TE buf fer. Bepalen de nieuwe bibliotheek zwembad concentratie met behulp van een reagens kwantificatie dsDNA volgens fabrikant ' s specificaties en de gemiddelde grootte piek zoals hierboven beschreven. Overgaan tot de sequentiebepaling en data analyse (artikelen 10 en 11). 10. Sequencing 75-base gekoppeld-einde sequencing uitvoeren op gebundelde bibliotheken 12. 11. gegevensanalyse Trim alle leesbewerkingen te verwijderen van de adapter sequenties, filteren op kwaliteit en lengte lezen. Opmerking: Dit kan gebeuren met behulp van cutadapt 1.2.1 20 met de opdracht ‘ cutadapt -f fastq–wedstrijd-lezen-jokertekens–quiet -m 15 – q 10 – een NNNNNNN < bestand >’, waarbij de NNNNNNN wordt vervangen door de werkelijke adapter volgorde en < bestand > is vervangen door de bestandsnaam fastq. Verwijderen van stuurlieden van luidt dat werden weggegooid in de vorige stap met behulp van aangepaste scripts. Uitlijnen Mate 1 blijven paren aan een index met de volgorde van alle oligonucleotides worden gebruikt voor de bereiding van de bibliotheek (bijvoorbeeld met behulp van Bowtie 0.12.8 21 en de opdrachtregel opties – m1-v2). Negeren van alle paren met succesvolle afstemmingen. Uitlijnen resterende paren aan het organisme referentie genoom met Bowtie via de opdrachtregel opties – v2 -X 10000–beste. Kaart leest die span tussen de mitochondriale molecuul begin en het einde door het uitlijnen van Mate 1 van alle unaligned paren (met Bowtie via de opdrachtregel opties – v2). Bepalen het aantal 5´-uiteinden voor alle interne en gepaarde einde uitlijning. Verschuiven van de positie van deze door een base stroomopwaarts naar de positie waar de gehydrolyseerde ribonucleotides. Export uit het bestand bowtie gegevensindeling naar een bestandsindeling van de bedgraph met behulp van aangepaste scripts voor visualisatie gemeen genoom browsers. Normaliseren van de leest voor elk onderdeel te lezen per miljoen. Met behulp van de positie en de graven van het bedgraph-bestand, verwijst naar het genoom van het organisme om te bepalen van de identiteit van incorporated ribonucleotides. Opmerking: Voor de menselijke mitochondriaal genoom leest van de regio’s 16,200-300 en 5,747-5,847 voor elk onderdeel moet worden uitgesloten, omdat deze gebieden veel vrije 5´-uiteinden die niets met ribonucleotide opneming door DNA polymerase γ bevatten. Verdelen van het totale luidt, niet met inbegrip van leest op de elf HincII-sites, met het gemiddelde aantal leest per HincII site om het aantal ribonucleotides per enkele streng pauze, (d.w.z. het aantal ribonucleotides per molecuul mitochondriale).