Uso de zinco sináptica histoquímica para revelar as diferentes regiões e lâminas no cérebro em desenvolvimento e adulto
Summary
Descrevemos um procedimento histochemical que revela a característico zinco laminar e areal, coloração de padrões em regiões diferentes do cérebro. O padrão de coloração de zinco pode ser usado em conjunto com outros marcadores anatômicos confiantemente distinguir camadas e regiões no cérebro adulto e em desenvolvimento.
Abstract
Caracterização da organização anatômica e funcional do cérebro e desenvolvimento requer a identificação precisa de circuitos neurais distintos e regiões no cérebro imaturo e adulto. Aqui descrevemos um procedimento coloração histoquímicos zinco que revela diferenças nos padrões de coloração entre diferentes camadas e regiões do cérebro. Outros têm utilizado este procedimento não só revelar a distribuição do zinco-contendo neurônios e circuitos no cérebro, mas também com sucesso delinear fronteiras areal e laminares no cérebro em desenvolvimento e adulto em diversas espécies. Aqui ilustramos este procedimento com imagens de desenvolver a coloração e cérebros adultos furão. Podemos revelar um padrão de zinco de coloração que serve como um marcador anatômico das áreas e camadas e pode ser usados confiantemente distinguir áreas corticais visuais no córtex visual adulto e em desenvolvimento. O objetivo principal do presente protocolo é apresentar um método histoquímico que permite a identificação exata das camadas e regiões no cérebro em desenvolvimento e adulto onde outros métodos não conseguem fazê-lo. Secundariamente, em conjunto com a análise de imagem densitométricos, este método permite avaliar a distribuição do zinco sináptica a revelar potenciais alterações ao longo do desenvolvimento. Este protocolo descreve detalhadamente os reagentes, ferramentas e etapas necessárias para manchar sucessivamente as seções do cérebro congelado. Embora este protocolo é descrito usando tecido cerebral de furão, facilmente pode ser adaptado para uso em roedores, gatos ou macacos, bem como em outras regiões do cérebro.
Introduction
Histológicas manchas tem sido tradicionalmente usadas para auxiliar na identificação de áreas corticais em várias espécies, revelando diferenças de características arquitetônicas. O uso combinado de técnicas histoquímicas como substância de Nissl, reatividade de citocromo oxidase (CO) ou mielina pode provar frutuoso, como revelam os limites areal semelhantes no cérebro adulto. No entanto, estas manchas histochemical não revelam sempre adequadamente limites claros entre áreas corticais e camadas no cérebro imaturo.
No sistema nervoso central, o zinco tem várias funções essenciais que incluem a estabilização da estrutura do DNA, agindo como um cofator de enzimas, participando em inúmeras funções reguladoras e agindo como um neuromodelador através da sua presença em vesículas sinápticas 1. zinco sináptico é único, como isso pode ser visualizado usando métodos histológicos, Considerando que o zinco ligados a proteína não pode ser visualizado2. Esta característica foi explorada para revelar o padrão de zinco sináptica em diferentes regiões corticais e histoquímica sináptica de zinco tem sido utilizada em um número de estudos. Um subconjunto de glutamatérgico neurônios no córtex cerebral contêm zinco nas vesículas pré-sináptica dentro seu axônio terminais3,4. Estudos histoquímicos revelaram uma distribuição heterogênea de zinco sináptica no córtex cerebral5,6,7. Parece haver uma distribuição diferente de areal e laminar de zinco histochemically reativa em diferentes regiões corticais (por exemplo, visual versus córtex somatossensorial), ou camadas (por exemplo, os níveis de zinco no supragranular e infragranular camadas do córtex visual primário são substancialmente superiores à camada de entrada de thalamocortical IV com níveis relativamente baixos de zinco sináptica)5,8,9. A heterogeneidade de zinco sináptico coloração observada no córtex é especialmente vantajosa como ele facilita a identificação de areal e laminar.
Aqui apresentamos uma descrição detalhada de um procedimento histochemical zinco sináptica, que é uma versão modificada do 1982 método10 do Danscher. Este método utiliza Selenito injectado intraperitonealmente (IP) em animais como um agente quelante. O selenite viaja para o cérebro para reagir com piscinas de zinco grátis encontradas em vesículas de um subconjunto de glutamatérgico sinapses no cérebro. Esta reação produz um precipitado que pode ser reforçado posteriormente pelo desenvolvimento prata2,10,11.
Esse procedimento revela padrões laminares e areal de zinco sináptico coloração; densitométricos análise pode ser utilizada para avaliar esses padrões, tanto qualitativa como quantitativamente no cérebro adulto e imaturo para estudar os efeitos de outras intervenções, tais como manipulações sensoriais, ambientais, farmacológicas ou genéticas. Além disso, um pode também querer avaliar possíveis alterações do desenvolvimento na distribuição de zinco sináptica em outras estruturas corticais ou subcorticais em outros sistemas de modelo. As informações quantitativas que análise densitométricos fornece neste método podem ser vantajosas para o desenvolvimento do cérebro seguir ao longo do tempo. Este protocolo fornece um companheiro para outros imuno – histoquímicos marcadores e para revelar os limites laminares e areal.
Protocol
Representative Results
Discussion
O estudo atual emprega uma técnica histochemical baseada em uma versão modificada do Danscher método (1982)10, pelo qual localização de zinco sináptica pode ser detectada e visualizada no cérebro. Esse método funciona, essencialmente, injetando o animal com o Selenito de sódio quelante de zinco (ND2SeO3) (15 mg/kg). Após a injeção, o selenite viaja para o cérebro e vincula a zinco grátis que está localizado a vesículas pré-sináptica de zinco que contém neur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações do centro nacional para recursos de pesquisa (2G12RR03060-26A1); O Instituto Nacional sobre saúde de minoria e disparidades de saúde (8G12MD007603-27) dos institutos nacionais de saúde; Profissional pessoal Congresso-City University de Nova York (CUNY-PSC); e faculdade Research Grant (FRG II) Universidade Americana de Sharjah. Agradecemos Vidyasagar Sriramoju por nos apresentar para esses métodos.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
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