Acidi grassi saturi indurre la morte delle cellule del macrofago Ceramide-collegato
Summary
Un metodo semplice per preparare BSA-degli acidi grassi coniugati e illustriamo un metodo semplice per derivare macrofagi murini primari da cellule del midollo osseo. Allora dimostriamo che gli acidi grassi saturi può indurre la morte delle cellule del macrofago, e tale morte delle cellule è associato positivamente con accumulo cellulare di ceramide livelli.
Abstract
I macrofagi esprimono altamente epidermica dell’acido grasso-proteina e proteina-acido grasso adiposa. Essi attivamente l’assorbimento saturata e acidi grassi insaturi, che potrebbe giocare un ruolo critico nella regolazione della loro funzioni immuni. Numerosi studi hanno dimostrato che vari acidi grassi, saturi o insaturi, può possedere diversi impatti sulla crescita delle cellule e la funzione. Tuttavia, gli approcci utilizzati per la preparazione dell’acido grasso variano, che può portare a risultati non-fisiologica. Albumina, un vettore naturale per gli acidi grassi nel sangue periferico dei mammiferi, è consigliabile per la formazione di un coniugato complesso con il sale di sodio degli acidi grassi per studiare la funzione dell’acido grasso in cellule di mammifero, riducendo così al minimo la tossicità dell’acido grasso sapone. Così, un semplice, relativamente rapido riscaldamento e sonicating metodo è sviluppato e presentato qui per la formazione di coniugato acido grasso-BSA. Descriviamo un protocollo utilizzando acidi grassi saturi, soprattutto gli acidi stearico di indurre morte cellulare severa nei macrofagi derivato del midollo osseo del topo. Noi dimostrare ulteriormente che la morte cellulare indotta da acido grasso saturo è associata positivamente con ceramide cellulare accumulato livelli. Questo metodo può essere esteso per lo studio dell’impatto dell’acido grasso sulle altre cellule di mammiferi.
Introduction
Acidi grassi svolgono un ruolo critico nel metabolismo energetico e nella sintesi dei fosfolipidi di membrana in diversi tipi di cellule. Gli acidi grassi hanno una bassa solubilità in acqua. Una preparazione adeguata degli acidi grassi è di importanza critica per studiare le funzioni biologiche degli acidi grassi nelle cellule dei mammiferi. Quando gli acidi grassi sono preparati con etanolo, molti acidi grassi può mostrare il loro effetto tossico sapone (detersivo) sulla membrana cellulare, anche a concentrazioni relativamente basse1. Come un trasportatore naturale, importante per gli acidi grassi liberi nel siero, l’albumina di siero è considerato un buon vettore per acido grasso consegna in vitro per acido grasso funzione analisi2,3,4. Tuttavia, i dettagli della preparazione del coniugato dell’acido grasso e albumina del siero non sono solitamente disponibili anche se sono stati pubblicati molti articoli di ricerca utilizzando gli acidi grassi.
I macrofagi esprimono altamente epidermica dell’acido grasso-proteina e adiposo dell’acido grasso-legante della proteina5,6,7,8. Essi attivamente l’assorbimento saturata e acidi grassi insaturi che possono regolare le loro funzioni immuni. Per studiare l’impatto degli acidi grassi sui macrofagi e altre cellule, diversi metodi di preparazione dell’acido grasso sono stati applicati1,7,9. Usando opportunamente preparato acido grasso/siero albumina coniugati per studiare l’impatto degli acidi grassi sulla funzione del macrofago è di importanza critica nell’ottenere dati biologicamente significativi. Studi sull’impatto degli acidi grassi sulla funzione del macrofago possono fornire conoscenze di base e potenziali bersagli terapeutici relativi al metabolismo dell’acido grasso nelle malattie del macrofago-coinvolti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La corretta preparazione della soluzione di acido grasso è di importanza critica per studiare la funzione biologica degli acidi grassi. La neutralizzazione degli acidi grassi aumenta la relativa solubilità in soluzione acquosa. Tuttavia, sali di sodio degli acidi grassi, soprattutto acidi grassi saturi, sono ancora di bassa solubilità in acqua o PBS, come abbiamo osservato. Un metodo consiste nell’utilizzare etanolo al 95-100% per aiutare a sciogliere l’acido grasso1. Utilizzando questo metodo,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto parzialmente dai fondi di Start-up Università di Louisville e National Cancer Institute (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
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