DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול
Summary
שיטה זו מאפשרת מכתים סלקטיבית, כימות של ה-DNA של ג’לים למסמס את הג’ל ירוקה SYBR אני / ניטרו Tetrazolium כחול פתרון וחשיפת אז זה אור שמש או מקור אור כחול. זה מייצר את התמיסה גלוי ודורשת כמעט ללא ציוד, שהופך אותו אידיאלי לשימוש שדה.
Abstract
שיטות מכתימים DNA חשובים מאוד למחקר ביורפואי. תיכננו שיטה פשוטה המאפשרת ויזואליזציה DNA בעין בלתי מזוינת על ידי היווצרות התמיסה צבעוניים. זה עובד על ידי השריה של אקרילאמיד או agarose DNA ג’ל בריכוז של 1 x (שקול ל- 2.0 מיקרומטר) SYBR Green אני (SG אני), מ מ 0.20 ניטרו כחול tetrazolium שמייצר סגול לזרז של formazan כאשר הם נחשפים לאור השמש או אור כחול במיוחד. בנוסף, בדיקות דנ א השחזור בוצעו באמצעות פלסמיד עמיד אמפיצילין ב ג’ל agarose צבעונית עם השיטה שלנו. מספר גדול יותר של המושבות הושג בשיטה שלנו מאשר עם מסורתיים מכתים באמצעות ג. אני עם תאורה אולטרה סגולה. השיטה המתוארת הוא מהיר ספציפיים, שאינם רעילים עבור זיהוי ה-DNA, המאפשר ויזואליזציה של מולקולות “בעין בלתי מזוינת” בלי transilluminator, והוא מתאים לשימוש שדה וזולה. מסיבות אלו, יש DNA החדש שלנו מכתים שיטה היתרונות הפוטנציאליים לפעילות המחקר והתעשייה.
Introduction
עם ההתקדמות לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, מחקרים שכללו דנ א דרושים טכניקות טובות יותר כדי לנתח את הדנ א. השיטה הראשונה עבור ה-DNA מכתים היה כסף מכתים, הרגישה מאוד אבל חסר סלקטיביות, אינו מאפשר שחזור הדגימה. מאוחר יותר, ההתפתחות של צביעת DNA פלורסנט מותר כימות סלקטיבי של ה-DNA עם האפשרות של שחזור הדגימה. אחד צבעי פלורסנט הראשון משמש DNA כימות היה אתידיום ברומיד1, אשר הוא מוטגניות2. עם זאת, כעת ישנם צבעי פלורסנט משופרת, כי הם יותר רגישים, כגון GelRed ו- SYBR Green ובטוחה אני (SG אני)3; אבל כל אלה צבעי פלורסנט מחייבות השימוש של אולטרה סגול (UV) transilluminator או fluorimeter.
ישנן טכניקות אחרות עבור בעליל מכתים ה-DNA, כגון מתילן כחול4 וקריסטל ויולט5,6,7,8,9, אך כל אלה סובלים רגישות מופחתת, סלקטיביות. המלחים tetrazolium הן תרכובות אורגניות רגישים צמצום, כאשר זה קורה הם יוצרים לא מסיס, formazan צבעוניים לזרז10,11. לאחרונה, כמה מלחים tetrazolium טרינארית הוכחו לאגד DNA עקב שלהם טבעות חיובי tetrazolium12.
האחרונות הפרסום13, הוצע טכניקה גלויה חדשה כדי להכתים ולכמת DNA ב לזיהוי ג’לים, באמצעות הפחתת מלח tetrazolium טרינארית בשם ניטרו כחול tetrazolium (NBT) ו צבעי פלורסנט כמו אתידיום ברומיד, GelRed, SYBR ירוק אני וזהב SYBR. התגובה הזו עבד בנוכחות אור כחול או אור שמש ואיפשר שחזור הדגימה עם איכות משופרת בהשוואה לשימוש של ס ג אני transilluminator UV. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט לשיטת ההגדלה באמצעות tetrazolium מלחי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הרומן ורגיש DNA מכתים שיטה מבוסס על הפחתת NBT השימוש של ס ג. הוצגתי במאמר זה. השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא זמן הדגירה של הג’ל ב NBT-ס ג אני פתרון וריכוז NBT. הזמן מוכתמים agarose ג’ל הוא ארוך יותר עבור אקרילאמיד ג’לים בשל עובי גדול יותר agarose ג’ל. שיטה זו אינה פועלת היטב בנוכחות מרחביות כפי NBT ארגונייט שו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Fondo נאסיונאל דה Desarrollo y אזור Tecnológico (Fondecyt), צ’ילה, פרויקט 11130263 (ל CW), פרויקט CONICYT + NERC + פרוגרמה דה Colaboración אינטרנסיונל PCI-PII20150073 (ל CW) ו- U-inicia מדה Vicerrectoría Investigación אוניברסידאד דה צ’ילה (ל CW).
תודה על טטיאנה נאראנחו-פלמה על העזרה בשלב הראשוני של הפרויקט, ד ר חורחה Babul, דייגו קירוגה-רוג’ר לדיון מועיל, רוברט Lesch עבור תיקון של כתב היד, Dirección דה extensión דה לה Facultad דה y Químicas עצמה Farmacéuticas מ אוניברסידאד דה צ’ילה. תודות גם מרסלו Pérez עבור עריכת הוידאו וסטיבנס ניל שתיקנת את הטקסט ואת ארול ווטסון למתן הקריינות.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
