Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung von menschlichen Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen des Interesses, ausgehend von seltenen B-Zellen im menschlichen Blut zirkulieren. Generation dieser natürliche Antikörper ist rasch und effizient, und die Antikörper erhalten können sehr ähnliche Antigene unterscheiden.
Abstract
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind mächtige Werkzeuge nützlich für beide Grundlagenforschung und in der Biomedizin. Ihre hohe Spezifität ist unverzichtbar, wenn der Antikörper sehr ähnliche Strukturen (z.B., ein normales Protein und eine mutierte Version davon) unterscheiden muss. Der aktuelle Weg erzeugen solche diskriminierenden mAbs beinhaltet umfangreiche Screening von mehreren Ab-produzierenden B-Zellen, ist kostspielig und zeitaufwendig. Wir schlagen hier eine schnelle und kostengünstige Methode zur Erzeugung von diskriminierendem, vollständig humaner mAbs ausgehend von menschlichem Blut zirkulierenden B-Lymphozyten. Die Originalität dieser Strategie ist durch die Auswahl der spezifischen Antigen Bindung B Zellen kombiniert mit dem Counter Auswahl aller anderen Zellen, mit leicht verfügbaren peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC). Sobald bestimmte B-Zellen isoliert sind, stammen cDNA (ergänzende Desoxyribonukleinsäure) Sequenzen Codierung für die entsprechenden mAb Einzelzelle Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Technologie und anschließend ausgedrückt in der Human- Zellen. Innerhalb von weniger als 1 Monat ist es möglich, Milligramm hochgradig diskriminierend menschlichen mAbs gegen nahezu jede gewünschte Antigen natürlich erkannt durch die B-Zell-Repertoires zu produzieren.
Introduction
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die schnelle und vielseitige Produktion vollständig humaner monoklonaler Antikörper (mAbs) gegen eine gewünschte Antigen (Ag). mAbs sind unverzichtbare Werkzeuge in vielen Grundlagenforschung Anwendungen in Vitro und in Vivo: flow Cytometry, Histologie, Western-Blot und blockierende Experimente zum Beispiel. Darüber hinaus werden mAbs mehr und mehr in der Medizin zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Transplantation Ablehnung1Steuern eingesetzt. Anti-CTLA-4 und Anti-PD-1 (oder Anti-PD-L1) mAbs dienten zum Beispiel kürzlich als immun Checkpoint-Hemmern bei Krebs-Behandlungen2.
Der erste mAbs stammen von Immunglobulin (Ig)-sezernierenden Hybridome aus der Milz Zellen der immunisierten Mäusen oder Ratten gewonnen. Allerdings behindert die starke Immunantwort gegen Murine oder Ratte mAbs ihre therapeutische Anwendung beim Menschen, durch ihre schnelle Abfertigung und die wahrscheinlich Induktion von Überempfindlichkeit Reaktionen3. Um dieses Problem anzugehen, haben teilweise tierisches Eiweiß-Sequenzen von mAbs menschlich, so genannte Chimäre Maus-Mensch oder humanisierte Antikörper erzeugen abgelöst. Diese Strategie verringert sich jedoch nur teilweise Immunogenität, während deutlich erhöht, die Kosten und die Zeit-Skala der Produktion. Eine bessere Lösung besteht darin, menschliche mAbs direkt aus humanen B-Zellen zu generieren und mehrere Strategien hierfür zur Verfügung. Eine davon ist die Verwendung von Phagen oder Hefe Display. Dies umfasst Anzeigen Variable Domänen aus einer kombinatorischen Bibliothek von zufälligen menschlichen Ig schwere und Licht Ketten auf Phagen oder Hefen und Durchführung einer Auswahlschritt mit den spezifischen Antigen des Interesses. Ein großer Nachteil dieser Strategie ist, dass schwere und leichte Kette nach dem Zufallsprinzip verbunden, was zu einer sehr großen Zunahme in der Vielfalt der erzeugten Antikörper sind. Antikörper, die erhalten sind voraussichtlich nicht denen entsprechen, die durch eine natürliche Immunantwort gegen ein bestimmtes Ag entstehen würde. Darüber hinaus sind menschliche Protein-Falte und post-translationalen Modifikationen nicht systematisch in Prokaryoten oder sogar in Hefen reproduziert. Eine zweite menschliche mAb-Produktions-Methode ist die Verewigung der natürlichen menschlichen B-Zellen durch Epstein – Barr-Virus-Infektion oder Ausdruck der Anti-apoptotische Faktoren BCL-6 und BCL-XL4. Allerdings ist diese Methode gilt nur für B-Gedächtniszellen und ist ineffizient, dass Screening von zahlreichen mAb-produzierenden verewigt B-Zellen, die nur wenige (wenn überhaupt) mAb-Klone mit der gewünschten Antigen-Spezifität zu identifizieren. Die Methode ist so teuer und zeitaufwändig.
Vor kurzem wurde ein neues Protokoll für die Produktion von menschlichen mAbs von isolierten einzelnen B Zellen5beschrieben. Es stützt sich auf eine optimierte einzellige Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Verstärkung der beiden die Heavy – und Lichterkette Codierung Segmente aus einer einzigen sortierten B-Zelle. Darauf folgt das Klonieren und die Expression dieser Segmente in einer eukaryotischen Expressionssystems, wodurch Wiederaufbau vollständig humaner MAB. Dieses Protokoll wurde erfolgreich ausgehend von B-Zellen von geimpften Spendern verwendet. Zellen wurden mehrere Wochen nach der Impfung zu höhere Frequenzen der B-Zellen gerichtet gegen die gewünschte Ag erhalten, und den Zeitaufwand für das screening von6geerntet. Anderen vollständig humaner mAbs wurden auch von+ (Human Immunodeficiency Virus) HIV-infizierten Patienten7 und Melanom Patienten8produziert. Trotz dieser Fortschritte gibt es noch keine Verfahren zur Verfügung, die die Isolation der Ag-spezifische B-Zellen unabhängig von ihrer Erinnerung Phänotyp oder Frequenz ermöglicht.
Hier beschriebenen Verfahrens führt zu effizienten ex Vivo Isolation der menschlichen zirkulierenden B-Zellen basierend auf ihre BCR Spezifität, gefolgt von der Produktion von vollständig humaner antigenspezifischen mAbs in hoher Ausbeute und mit einer niedrigen Screening-Zeit. Die Methode ist nicht zu B-Gedächtniszellen oder Antikörper-sezernierenden B-Zellen nach einer Immunantwort induziert beschränkt, sondern kann auch auf das menschliche naive B-Zelle Repertoire angewendet werden. Es funktioniert sogar ab Ag-spezifische B-Zellen bei sehr tiefen Frequenzen ist ein guter Indikator für die Effizienz. Das Prinzip der Methode ist wie folgt: periphere Blut mononukleären Zellen (PBMC) sind mit zwei Tetramers präsentiert das Antigen des Interesses befleckt, jeder gekennzeichnet mit einem unterschiedlichen Fluorochrom (z. B.Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC)), und eine dritte Tetramer präsentiert eine eng verwandte Antigen konjugiert mit einem dritten Fluorochrom (z. B.Brillant violett 421 (BV421)). Um für Antigen-bindenen Zellen anzureichern, Zellen werden dann mit Perlen mit Anti-PE beschichtet inkubiert und Anti-APC Abs, und in Zelle Trennung Spalten sortiert. Die APC PE+ + Zelle Bruchteil ausgewählt ist, gebeizt mit einer Vielzahl von mAbs spezifisch für verschiedene PBMC Zelltypen zur Identifizierung von B-Zellen und unterworfenen Zytometrie Zellsortierung fließen. B-Zellen sind PE+ und APC+, aber brillant violett–, sind isoliert. Dieser Schritt wählt gegen Zellen, die nicht B-Zellen oder binden Sie nicht an die tetramerized Antigen, sondern binden PE oder APC (diese Zellen werden PE+ APC– oder PE– APC+) oder zum Teil nicht-Antigen der Tetramers verwendet (diese Zellen werden BV421+). B-Zellen nicht hochspezifisch für das Epitop von Interesse sind auch Counter bei diesem Schritt ausgewählt (diese Zellen werden auch BV421+). Somit kann diese Methode hochspezifische B-Zellen, B-Zell-Rezeptoren (BCR) in der Lage ist zu unterscheiden zwischen zwei eng verwandte Antigene ausdrücken reinigen. Einzelne spezifische B-Zellen sind in Tuben gesammelt und ihre PCR verstärkt Ig cDNAs (ergänzende Deoxyribonucleic Säuren) geklont und durch eine menschliche Zelllinie als sekretierten IgG mAbs ausgedrückt.
Diese Studie beschreibt, wie ein Proof of Concept, die effiziente Erzeugung von menschlichen mAbs, die erkennen, eine Peptid mit einem großen Histocompatibility complex-Klasse habe ich vorgelegt (MHC-ich) Molekül und kann unterscheiden dieses Peptid und anderen Peptiden beladen auf dem gleichen MHC-ich Allel. Obwohl der Grad der Komplexität dieser AG wichtig ist, können mit dieser Methode (i) high-Yield-Rückgewinnung von Ag-spezifische mAbs; (Ii) Produktion von mAbs in der Lage, zwischen zwei strukturell enger Ags zu unterscheiden. Dieser Ansatz zu geimpften oder infizierten Patienten ohne jegliche Änderung Protokoll erweitert werden und hat auch bereits in einem humanisierten Ratte System9erfolgreich umgesetzt. Diese Studie beschreibt also, eine vielseitige und effiziente Vorgehensweise um vollständig humaner mAbs, die verwendet werden können in Grundlagenforschung und Immuntherapie zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgeschlagene Protokoll ist eine leistungsfähige Methode für die Erzeugung von menschlichen mAbs direkt vom Ag-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden. Es vereint drei wichtige Aspekte: (i) die Verwendung von ein Tetramer-assoziierte magnetische Anreicherung, wodurch eine ex-Vivo -Isolierung auch seltene Ag-Bindung B-Zellen; (Ii) eine gating Strategie, die drei Ag-Tetramers (zwei relevante und irrelevante eins) beschriftet mit drei verschiedenen Fluorochromes verwendet, um durch Durchflusszytometrie, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Zytometrie Anlage “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für kompetente technische Unterstützung. Wir danken auch das gesamte Personal der Produktion rekombinanter Proteine (P2R) und der Auswirkungen Plattformen (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) für ihre technische Unterstützung. Wir danken Emmanuel Scotet und Richard Breathnach für konstruktive Kritik am Manuskript. Diese Arbeit wurde von der IHU-Cesti-Projekt gefördert durch die «Investissements Avenir» französische Regierung Programm, verwaltet von der französischen nationalen Forschung Agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005) finanziell unterstützt. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Métropole und Région Pays De La Loire unterstützt. Diese Arbeit wurde im Rahmen des Programms LabEX IGO unterstützt vom nationalen Institut über die Investition des zukünftigen Programms ANR-11-LABX-0016-01 realisiert.
Materials
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
References
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