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유전학

Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten

Published: November 08, 2017
doi:
10.3791/56470
, , , , ,
1Laboratory of Plant Genetics and Development,Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory,University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School,Li Shui University

Summary

Dieses Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopie Zahl Variationen in interessieren Pflanzen.

Abstract

Mutanten sind wertvolle genetische Ressourcen für Funktionsstudien gen. Um mutierte Sammlungen zu generieren, können drei Arten von mutagenen genutzt werden, einschließlich biologischer wie T-DNA oder Transposon, chemische wie Ethyl Methanesulfonate (EMS) oder physische wie Ionisation Strahlung. Die Art der Mutation beobachtet variiert je nach der Mutagen verwendet. Ionisation Strahlung induzierten Mutanten sind Mutationen löschen, duplizieren oder Neuordnung. Während T-DNA oder Transposon-basierte Mutagenese, auf Arten, die zur Transformation unterliegen beschränkt, kann chemische oder physikalische Mutagenese auf verschiedenste Arten angewendet werden. Allerdings stützt sich die Charakterisierung der Mutationen abgeleitet von chemischen oder physikalischen Mutagenese traditionell auf eine kartenbasierte Klonen Ansatz, ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Hier zeigen wir, dass eine High-Density-Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (aCGH) Plattform angewendet werden kann, um effizient zu erkennen und zu charakterisieren, Kopie Nummer Variationen (CNV) in Mutanten abgeleitet von schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in Medicago Truncatula, ein Leguminosenarten. Gesamte Genom-Sequenzanalyse zeigt, dass es mehr als 50.000 Gene oder gen Modelle in M. Truncatula. Im vorliegenden, FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula stammen aus mehr als 150.000 Linien, M1, die wertvolle genetische Ressourcen für funktionelle Studien der Gene im Genom darstellen. Die hier beschriebenen aCGH-Plattform ist ein effizientes Werkzeug zur Charakterisierung von FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula.

Introduction

Hülsenfrüchte (Fabaceae) sind die drittgrößte Familie der Blütenpflanzen, mit vielen wirtschaftlich wichtige Arten wie Soja (Glycine Max) und Alfalfa (Medicago Sativa). Hülsenfrucht Pflanzen können interagieren mit Stickstoff-fixierenden Bodenbakterien, im allgemeinen genannt Rhizobien Wurzelknöllchen zu entwickeln, in denen die atmosphärische Distickstoff auf Ammoniak für den Einsatz von der Wirtspflanze reduziert wird. Als solche Anbau von Leguminosen Pflanzen erfordert wenig Input von Stickstoffdüngemitteln und trägt somit zu einer nachhaltigen Landwirtschaft. Hülsenfrucht Getreide produzieren Blätter und Samen mit hohem Proteingehalt, dient als ausgezeichnete Futter und Getreide. Kultivierte Leguminosenarten haben jedoch in der Regel komplexe Genom Strukturen, wodurch funktionelle Studien von Genen, die Schlüsselrollen in Leguminosen-spezifische Prozesse umständlich zu spielen. Medicago Truncatula wurde weit als eine Art Modell für Hülsenfrucht Studien angenommen worden, vor allem, weil (1) es hat eine diploide Genom mit einer relativ kleinen haploiden Genomgröße (~ 550 Mbp); (2) Pflanzen können stabil für funktionelle Studien gen umgewandelt werden; und (3) Es ist eng verwandt mit Luzerne (M. Sativa), die Königin der Futterpflanzen und viele andere wirtschaftlich bedeutenden Kulturen für Translationale Studien. Vor kurzem, die Genomsequenz des M. Truncatula cv Jemalong A17 wurde freigegeben1,2. Anmerkung des Genoms zeigt, dass mehr als 50.000 vorhergesagten Genen oder gen-Modelle im Genom vorhanden sind. Um festzustellen, die Funktion der meisten Gene in die M. Truncatula ist Genom eine anspruchsvolle Aufgabe. Um funktionelle Studien von Genen zu erleichtern, eine umfassende Sammlung von Mutanten in den Bereich von mehr als 150.000 M1 Zeilen generiert wurde mit schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in M. Truncatula cv Jemalong A173 ,4. Schnellen Neutronen, einer hochenergetischen Ionisation Mutagen, worden ist bei der Schaffung von Mutanten in vielen Pflanzenarten, darunter Arabidopsis5,6, Reis (Oryza Sativa)7, Tomate (Solanum verwendet Lycopersicum), Sojaöl (Glycine Soja; G. max)8,9, Gerste (Hordeum Vulgare) und Lotus Japonicus10. Ein Großteil der Mutationen von FNB Mutagenese abgeleitet sind aufgrund von DNA-Löschungen, liegen in der Größenordnung von ein paar Basenpaare an Mega Basenpaare9,11. Viele Phänotyp-Assoziierte Gene wurden erfolgreich identifiziert und charakterisiert,4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. zuvor molekularen Klonen der zugrunde liegenden Gene von FNB Mutanten stützte sich auf eine Karte-basierte Ansatz, der ist zeitaufwendig und begrenzt die Anzahl der Mutanten auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Vor kurzem mehrere kostenlose Ansätze einschließlich Protokoll-basierte Methoden, Genom Fliesen Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) für DNA-Kopie Nummer Variation Erkennung und kompletten Genoms eingesetzt zur Erleichterung der Charakterisierung der Löschung Mutanten in verschiedenen Organismen, einschließlich der Tiere und Pflanzen20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

Um die Charakterisierung der FNB Mutanten in M. Truncatula, ein Vollständiggenom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) zu erleichtern hat die Plattform entwickelt und validiert. Wie berichtet in tierischen Systeme kann die Array-CGH Plattform Kopie Nummer Variationen (CNV) auf der Ebene der gesamten Genoms in M. Truncatula FNB Mutanten. Darüber hinaus Läsionen können mittels PCR bestätigt werden und Löschung Grenzen durch Sequenzierung identifiziert werden können. Insgesamt ist der Array-CGH-Plattform ein effizientes und effektives Werkzeug bei der Identifizierung von Läsionen in M. Truncatula FNB Mutanten. Hier werden die Array-CGH-Verfahren und PCR Charakterisierung der Löschung Grenzen in einem M. Truncatula FNB Mutant illustriert.

Das folgende Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopienzahl interessieren Variationen in Pflanzen. Als Beispiel diente Medicago Truncatula FN6191 Mutant Löschung Regionen und Kandidatengene zugeordnete mutierten Phänotypen zu identifizieren. M. Truncatula FN6191 Mutant, ursprünglich von einem schnellen Neutronen Bombardierung verursachten Löschung mutierten Sammlung32 isoliert (siehe Tabelle der Materialien), stellte einen hyper-Nodulation Phänotyp nach Inokulation mit dem Boden Bakterium, Sihorhizobium Meliloti Sm1021, im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen.

Protocol

Hinweis: Abbildung 1 zeigt die fünf Schritte für das Array CGH-Protokoll. Sie sind: 1) Vorbereitung der pflanzlichen Stoffen; (2) Isolierung von DNA-Proben von hoher Qualität; (3) Kennzeichnung und Reinigung von DNA-Proben; (4) Hybridisierung, waschen und das Scannen des gesamten Genoms Arrays; und 5) CGH Datenanalyse. M. Truncatula gesamte Genom Tiling Arrays enthalten insgesamt 971.041 einzigartige Oligo-Sonden, die Ausrichtung auf mehr als 50.000 Gene oder gen-Modelle in das…

Representative Results

Abbildung 2 zeigt die Verteilung der normalisierten Log2 Verhältnisse der Mutant versus WT Signale über das gesamte Genom. Analyse der CGH Daten ergab eine ungefähre 22 kb Löschung auf Chromosom 4, das umfasst die gesamte SUNN gen33 und mehrere andere kommentiert Gene in FN6191 Mutant (Abbildung 2, Abbildung 3). Die Kandidat gelöschten Region wurde dur…

Discussion

Haben wir eine Array-CGH Plattform für die Erkennung und Charakterisierung von schnellen Neutronen Bombardement (FNB)-induzierten Mutanten in M. Truncatula CV Jemalong A17. Um die Verwendung von Array CGH Methode bei der Aufdeckung von Gen-Mutationen zu demonstrieren, führten wir aCGH Analyse des mutierten FN6191, die einen hyper-Nodulation Phänotyp im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen ausgestellt, wenn mit S. Meliloti Sm1021geimpft. Für die Segmentierung Analyse galt ein Segment erhebliche wenn das Log…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird teilweise durch einen Zuschuss von NSF Pflanzengenomforschung (IOS-1127155) finanziert.

Materials

Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9
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References

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Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).
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