化细胞穿透肽研究胞内蛋白-蛋白质相互作用

所有的实验程序都是在萨拉曼卡大学进行的。 1. 细胞 在开始手术前两天, 将所需密度的细胞板在实验当天汇合。将细胞放入烧瓶或盘子中。然而, 蛋白质提取将更容易从板块。每项实验的每个条件, 都可以方便地准备至少4块 78 cm2或2烧瓶的 150 cm2 , 以确保结果是一致的。 在本研究中, 板人 G166 GSCs 4 烧瓶的150厘米2, 培养在 RHB-一个干细胞培养基补充 2% B27, 1% N2, 20 ng/毫升 EGF 和 b-细胞生长因子描述的波拉德 et al.22。到达汇合的过程。例如, 当 5 x 106 G166 单元被镀在 150 cm2烧瓶中时, 它们是在电镀后2天处理的。 2. 化南太常委会 三十年代在 8200 x g上旋转含有冻干化南常委会 (BCPPs) 的小瓶, 以避免盖子上残留的一些粉末。包括一个控件 BCPP, 以确保找到的交互是特定于目标序列的。在本研究中, 控制 BCPP 是达生物素 (达 b) 和治疗 BCPP 是 TAT-Cx43266-283-b。其他控制可以使用, 如达熔化到混乱或突变的片段结合到生物素。 将相应培养基中的 BCPPs 溶解到制造商所指示的库存溶液中;例如, 获得2毫克/毫升 BCPP 的股票解决方案, 以治疗 GSCs 添加0.5 毫升的 GSC 培养基到一瓶含有1毫克的 BCPP。涡流, 并确保肽是很好的溶解。 3. 管材 注: 7 节所需的每项条件至少准备十二1.5 毫升管。 标记前3管每个条件。它们将在步骤6.4 中获得细胞裂解的总体积。 标记 A 在每条件3管。这些管子将有第一清获得后, 溶和纺纱细胞裂解, 步骤7.2。 每条件3根管子上标一 B。这些管子将有一个小分的第一清。这些裂解将用作步骤7.3 中的印迹样本。 每条件3根管子上标一个 C。这些管子将有清获得后, 下拉 NeutrAvidin, 步骤7.7。注意: 这是重要的情况下, 西方印迹没有显示蛋白质的信号, 这意味着蛋白质没有被拉下来或失去了在程序的某些步骤。如果是这种情况, 重复的过程, 以拉下来的蛋白质。 4. BCPPs 的细胞治疗 吸气培养基。 根据孵化时间, 将所需的培养基的体积 BCPPs 在尽可能小的介质中, 取代相应的新鲜培养基体积。这是非常重要的, 在任何情况下, 介质完全覆盖板/烧瓶的整个表面, 使细胞不干, 例如, 6 毫升每 150 cm2为30分钟的孵化。 在细胞培养物中加入 BCPP 的储存液的体积, 以达到被证明有效的浓度。在本研究中, 50 µM TAT-Cx43266-283B 已被证明可以减少 GSC 的增殖。 因此, 添加92.8 µL 2 毫克/毫升 TAT-Cx43266-283-b (兆瓦 = 3723.34 克/摩尔) 每毫升培养基, 以获得最终浓度50µM TAT-Cx43266-283-b。如果要添加的体积是不同的控制肽, 完成与文化培养基多达相同的最终卷。例如, 49.1 µL 达 b (兆瓦 = 1914.31 克/摩尔) 加上43.7 µL GSC 培养基增加每毫升培养基, 以获得最终浓度50µM 达 b。 将细胞放在37° c 和 5% CO2中, 以确保 BCPP 和其胞内伙伴之间的相互作用发生。如果相互作用需要更长的时间, 孵育时间更长或调整时间, 以防实验由时效。此外, 通过刺激不同的细胞内信号通路, 可以促进或防止兴趣的相互作用。 5. 缓冲器和解决方案。 制备 PBS pH 值 7.4: 136 毫米氯化钠;2.7 毫米氯化钾;7.8 mM Na2HPO4· 2H2O;1.7 mM2PO4。 准备蛋白质裂解缓冲液:20 毫米三盐酸 (pH 8.0), 137 毫米氯化钠, 1% IGEPAL, 使用前, 添加以下: 1/100 (v/v) 蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 1 毫米氟化钠, 1 毫米 Phenylmethanesulfonyl 氟化物 (PMSF) 和0.1 毫米钠钒。 准备 Laemmli 缓冲液: (4x: 0.18 m 三盐酸盐 pH 值 6.8; 5 米甘油; 3.7% SDS (p/五); 0.6 米β-基或9毫米的双制式; 0.04% (v/v) 溴蓝色 (BB))。 6. 蛋白质提取 注意: 蛋白质提取是按照先前描述的20,23进行的。在4° c 执行这个过程的整个部分。 完全吸取培养基。 洗涤 3 x 10 毫升与 ice-cold 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 每 150 cm2非常仔细地避免细胞脱离。 要获得细胞裂解, 添加3毫升的裂解缓冲每 150 cm2 , 并彻底刮表面使用一个细胞刮板。倾斜的板/烧瓶约45度将使更容易收集细胞裂解到相应的管。 在三1.5 毫升的管子中, 每管倒入1毫升的细胞裂解液。这些管将被标记的条件和复制, 如步骤3.1 所示。 7. 下拉 离心1.5 毫升管在 1.1万x g为10分钟在4° c。 将清转到新管 (A)。 每一个条件对不同的管子 (B) 分, 即每管50µL。添加 4x Laemmli 缓冲器 (16.6 µL 50 µL 的裂解液), 并在-20 ° c 冻结。这些裂解将作为通常的西方印迹样品。 质很好的 NeutrAvidin 琼脂糖由温和的晃动。削减吸管提示, 以增加其直径和改善移的珠子。在 (A) 管中加入50µL NeutrAvidin 琼脂糖每毫升的细胞裂解液。 在4° c 的夜间孵育, 以非常温和的晃动, 让 NeutrAvidin 与 BCPPs 的细胞内伙伴进行互动。 离心机在 3000 x g为1分钟在4° c, 以收集 NeutrAvidin 与蛋白质的复合物。 小心拆卸清, 并将其转移至清洁管 (C)。让他们使用它们, 以防下拉不成功。 洗涤步骤: 添加新鲜的裂解缓冲颗粒 (管 A), 重的反演和重复步骤 7.6) 和 7.7) 5 次。所有这些清都可以被丢弃。 卸下清, 并将 2x Laemmli 缓冲器添加到所需的最终音量 (40 µL 每1.5 毫升的管状颗粒从150厘米2的汇合细胞的烧瓶中获得)。 洗在100° c 为 5 min 离解蛋白质和离心机之间的互作用在三十年代在 8200 x g到药丸 NeutrAvidin 珠子。 采取清, 包含分离的蛋白质, 与毛细管提示到新的管子 (D)。如果需要重复洗脱步骤, 可以保留珠子。注: 清 (管 D) 现在已经准备好被装载在西部污点或结冰在-20 ° c。 8. 西部污点 注意: 西方印迹是按照先前描述的24执行的。 在一个 Midi 细胞电泳系统中, 在双三 (4-12%) midigels 上每个车道上的每道样本的负载当量体积。 Transblot 蛋白质使用干燥的印迹系统到一个硝化棉规则栈。 用10% 胭脂红将膜染色10分钟。 冲洗膜 3 x 5 分钟, 5 毫升的 TTBS。 用7% 的牛奶在 TTBS 1 小时内用管子或小盒子轻轻摇动来阻挡细胞膜。确保所用的容积足以覆盖膜, 并且它们不干燥,即每整个 midi 膜40毫升。 用5毫升的 TTBS 洗涤 3 x 5 分钟。 在4° c 的夜间孵育, 用主要抗体对感兴趣的蛋白质进行温和摇动。 用5毫升的 TTBS 洗涤 3 x 5 分钟。 在室温下用 TTBS 的过氧化物酶共轭二抗体在1小时内孵育膜。 用5毫升的 TTBS 洗涤 3 x 5 分钟。 用化学发光系统中的化学发光基材进行开发。 9. 解决问题 如果在开发西部污点以后任何样品没有显示信号在所有为蛋白质, 检查胭脂红。注: 在胭脂红的膜应显示未定义和众多的乐队沿车道加载。如果带子不是非常引人注目, 装载的蛋白质的数量可能不是足够或转移可能不正确地。考虑重复西方的印迹。 如果在任何车道的胭脂红膜上都没有污渍, 则从 (C) 管中的步骤7.4 中重复整个过程。 如果在开发西部污点以后蛋白质信号是非常微弱的, 但胭脂红显示蛋白质, 再孵育膜与主要抗体为更长的时间。如果信号仍然相当微弱, 在室温下再次孵育。 10. 本文中使用的其他技术 BCPPs 的免疫细胞化学 将单元格固定在4% 甲醛 (0.2 毫升/cm2) 中, 用于 20 min。 洗涤 3x 5 分钟 PBS (0.2 毫升每 cm2)。 应用相应的抗体 (至少0.15 毫升每 cm2) 稀释抗体溶液在制造商的指示浓度对您的蛋白质的兴趣过夜在4° c。 在室温下, 用荧光共轭的二次抗体 (每 cm2) 孵育2小时。 重复步骤 10.1. 2-10.1. 4 与其他抗体对抗你的蛋白质的兴趣。注意不要将相同的物种用于不同的主抗体或相同的波长荧光用于二次抗体。 使用 antifade 试剂 (每 cm2) 安装单元格 (0.005 毫升)。 对与数码相机相连的荧光显微镜进行分析。 mtt 法 培养细胞在37° c 在 24-井板材。 孵育在黑暗中的细胞75分钟与0.15 毫升培养基每 cm2含有0.5 毫克/毫升 MTT。 吸入培养基, 在黑暗中孵育10分钟的细胞, 用二甲基亚砜 (0.25 毫升每 cm2) 进行轻度震动。 使用微读取器测量波长为 570 nm 的吸光度。