मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण
Summary
यहां, हम पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस और छवि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-प्रारंभिक चरण माउस भ्रूण के मात्रात्मक volumetric विश्लेषण आधारित है । हम गुणात्मक और मात्रात्मक विकास के दौरान हृदय संरचनाओं का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में इस तकनीक मौजूद है, और यह व्यापक रूप से अन्य अंग प्रणालियों के लिए अनुकूलनीय हो सकता है कि प्रस्ताव.
Abstract
इमेजिंग तकनीक कभी आगे बढ़ाने का उपयोग भ्रूण के विकास की हमारी वृद्धि की समझ के लिए मोटे तौर पर योगदान दिया है । पूर्व आरोपण विकास और organogenesis अनुसंधान के दो क्षेत्रों है कि इन अग्रिमों से बहुत लाभांवित किया है, डेटा की उच्च गुणवत्ता के कारण है कि सीधे इमेजिंग पूर्व आरोपण भ्रूण या पूर्व vivo अंगों से प्राप्त किया जा सकता है । जबकि पूर्व आरोपण भ्रूण विशेष रूप से उच्च स्थानिक संकल्प के साथ डेटा उपज है, बाद में चरणों गया है कम तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए उत्तरदाई है । भाग्य मानचित्रण या आनुवंशिक वंश अनुरेखण के साथ संयोजन में ज्ञात भ्रूण संरचनाओं के लिए उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी या volumetric डेटा प्राप्त करने morphogenetic embryogenesis के दौरान जगह लेने की घटनाओं का एक अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए अनुमति देगा ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण है कि लेबलिंग, दृश्य के लिए अनुमति देता है, और विकासशील कार्डियक वर्धमान, एक प्रमुख दिल के विकास के दौरान गठित संरचना के भीतर जनक कोशिका आबादी के ठहराव । दृष्टिकोण इस तरह से बनाया गया है कि कोशिका और ऊतक दोनों स्तर की जानकारी प्राप्त की जा सकती है । फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण का प्रयोग, इस प्रोटोकॉल इस प्रकार के दौरान विशिष्ट जनक आबादी के स्थानीयकरण और संगठन का विश्लेषण करने की क्षमता प्रदान करने, कार्डियक वर्धमान के तीन आयामी स्थानिक पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है दिल के विकास के इस महत्वपूर्ण चरण । महत्वपूर्ण बात, संदर्भ एंटीबॉडी का उपयोग कार्डियक वर्धमान के लगातार मास्किंग और वर्धमान के भीतर क्षेत्रों के बाद मात्रात्मक माप के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल केवल जल्दी दिल के विकास की एक विस्तृत परीक्षा में सक्षम नहीं होगा, लेकिन साथ रूपांतरों जल्दी somite स्टेज माउस भ्रूण को गेसट्रुला में सबसे अंग प्रणालियों के लिए लागू किया जाना चाहिए ।
Introduction
organogenesis का अध्ययन लंबे समय से विकासशील भ्रूण में morphogenetic घटनाओं के अवलोकन पर भरोसा किया है । ये अध्ययन अक्सर फ्लोरोसेंट रंजक या परिभाषित संदर्भ आबादी के लेबलिंग के साथ संयोजन में रिपोर्टर अनुरेखण वंश के उपयोग पर निर्भर करते हैं । 1 इन लेबल्स की सापेक्ष स्थितियों की तुलना करके, जानकारी को मूल, आंदोलन, या ब्याज की जनसंख्या के अंतिम योगदान पर बटोरा जा सकता है । प्रत्यारोपण और भाग्य मानचित्रण प्रयोगों या तो रूपात्मक स्थलों या गैर में रंजक के इंजेक्शन का उपयोग-gram वंश ब्याज की कोशिकाओं के प्रारंभिक बिंदु को परिभाषित करने के लिए, जो तब विकसित भ्रूण के लिए योगदान की जांच कर रहे हैं । 2 , 3 , 4 , 5 आनुवंशिक वंश-प्रयोग अनुरेखण अच्छी तरह से परिभाषित रिपोर्टर alleles कि प्रयोगात्मक हेरफेर के बिना सेल आबादी लेबल के लिए उपयोग किया जाता है के साथ एक ही अवधारणा का उपयोग करें । इन तरीकों की कुंजी के लिए निर्धारित करने की क्षमता है, उच्च स्थानिक संकल्प के साथ, प्रयोगात्मक और संदर्भ लेबल के स्थानों । इन दृष्टिकोणों से पूर्व आरोपण विकास और explant organogenesis अध्ययन में बकाया प्रगति की उपज हुई है. ६ , 7 , 8 , 9
आबाद हार्ट morphogenesis की विकासात्मक घटनाएँ हाल के वर्षों में अच्छी तरह से बताई जा रही हैं. अनुसंधान के इस क्षेत्र में प्रमुख खोजों में से 10 एक जनक आबादी है कि अद्वितीय मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है की एक संख्या का वर्णन है । 11 इन आबादियों में शामिल है पहली और दूसरी दिल के खेतों (FHF और SHF), जो भ्रूण के पूर्वकाल की ओर में कार्डियक वर्धमान के भीतर मौजूद हैं (ई) ८.२५ माउस के विकास के दिन । 12 इन आबादियों अक्सर व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के संयोजन के माध्यम से जांच कर रहे हैं, जो ऊतक स्तर की जानकारी प्रदान करता है, और धारावाहिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख, जो उच्च सेलुलर संकल्प प्रदान करता है, लेकिन केवल के साथ अनुभाग दो आयामी स्थानिक जानकारी । 13 इस प्रकार, जबकि इन अध्ययनों से बहुत दिल के विकास की हमारी समझ को उंनत किया है, उपलब्ध तरीकों morphogenesis की गहराई मात्रात्मक विश्लेषण में इन चरणों के दौरान सीमित है, की जांच करने के दृष्टिकोण के लिए की जरूरत बनाने एक पूरे जीव के स्तर पर इन आबादियों के संगठन ।
दोनों फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी छवि विश्लेषण में हाल ही में प्रगति उच्च संकल्प और रिश्तेदार आसानी से सीटू में कोशिकाओं और संरचनाओं के उच्च प्रवाह एल्गोरिथम पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देते हैं, इस प्रकार जटिल के विस्तृत अध्ययन के लिए जिस तरह से फ़र्श सेलुलर संरचनाओं । 14 अभिकलनी शक्ति की वृद्धि और बड़े डेटा के प्रबंधन एल्गोरिदम के विकास के साथ, दोनों इमेजिंग डेटा के आकार की घातीय वृद्धि को संभालने के लिए आवश्यक-सेट, विश्लेषण अब पूरी तरह से स्वचालित किया जा सकता है । इमेजिंग डेटा-सेट्स के 15 स्वचालित विश्लेषण में निष्पक्ष होने का लाभ होता है, लेकिन यह केवल इनपुट डेटासेट की गुणवत्ता के रूप में विश्वसनीय है; यह आवश्यक है, तो, कि सर्वोत्तम प्रथाओं अधिग्रहण और छवि पूर्व प्रसंस्करण के दौरान उच्चतम गुणवत्ता, निष्पक्ष विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किया जाता है । 16 प्रोटोकॉल पूरी तरह से स्वचालित और reproducibility के लिए साझा किया जा सकता है, और मालिकाना सॉफ्टवेयर द्वारा इस्तेमाल एल्गोरिदम आसानी से पुस्तकालयों के माध्यम से उपलब्ध आधुनिक स्वामित्व या खुले स्रोत के साथ परिचित है जो वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल किया जा करने के लिए कर रहे हैं डेवलपर उपकरण । 17
निंनलिखित प्रोटोकॉल organogenesis के एक अच्छी तरह से परिभाषित मॉडल पर इस तरह के विश्लेषण करने के लिए आवश्यक कदम बताते हैं, हृदय विकास के दौरान कार्डियक वर्धमान के गठन । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे करने के लिए (1) फसल और टुकड़े कार्डियक वर्धमान स्टेज भ्रूण, (2) संदर्भ के लिए पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन (Nkx2-5) और प्रयोगात्मक (Foxa2Cre: YFP18,19) मार्करों, (3) तैयार और छवि फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर भ्रूण, और अंत में (4) का विश्लेषण और जिसके परिणामस्वरूप छवियों उन्नत तीन आयामी दृष्टिकोण का उपयोग कर. जबकि कार्डिएक वर्धमान एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है यहां, उचित संशोधन के साथ, इस प्रोटोकॉल गेसट्रुला में कई वंश के विश्लेषण के लिए जल्दी somite चरण भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
यहां बताए गए सभी तरीकों को माउंट सिनाई स्थित Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी ने मंजूरी दी है ।
1. हार्वेस्टिंग और कार्डियक वर्धमान स्टेज भ्रूण प्रसंस्करण …
Representative Results
Discussion
इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के बाद आरोपण माउस भ्रूण से मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए एक रणनीति का वर्णन । जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, 3 डी volumetr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH/NHLBI R56 HL128646 और Mindich बाल स्वास्थ्य और विकास संस्थान (MCHDI) ISMMS (जवाबतलब) द्वारा वित्त पोषित किया गया । E.B. एक NIH/NIDCR प्रशिक्षु T32 HD075735 द्वारा समर्थित है । सूक्ष्म और छवि विश्लेषण माउंट सिनाई, जो भाग में माउंट सिनाई P30 CA196521 में Tisch कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित है पर Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन में माइक्रोस्कोपिक कोर पर प्रदर्शन किया गया था-कैंसर केंद्र सहायता अनुदान ।
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
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