Multiplex Cytokine Profilatura degli Splenocytes stimolati Mouse utilizzando una piattaforma basata su Cytometric Bead Immunoassay

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le raccomandazioni di NIH contenute all’interno della Guida per la cura e l’uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal IACUC presso BioLegend. Figura 1: filtro piatto dosaggio procedura riepilogo. Il protocollo per eseguire il dosaggio utilizzando piastre filtranti è rappresentato come un diagramma raffigurante chiave dosaggio componenti e fasi di incubazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 1. preparazione del campione biologico Nota: il sito anatomico prescelto e il volume della raccolta del sangue è lasciata alla discrezione di ogni singolo ricercatore e non influiranno sul risultato del test. Tuttavia, una volta che sono ottenuti, i campioni devono essere smaltiti secondo i passaggi elencati di seguito. Preparazione di campioni di siero raccogliere il volume di sangue in provetta di raccolta preferita e lasciarlo coagulare per almeno 30 min. Centrifugare il campione per 10 min a 1.000 x g e a temperatura ambiente. Rimuovere siero e dosaggio immediatamente o aliquota in polipropilene per microcentrifuga e conservare i campioni a ≤ -20 ° C. Preparazione di campioni di Plasma raccogliere il volume di sangue utilizzando acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) rivestito provette per prelievo ematico. Centrifuga per 10 min a 1.000 x g e a temperatura ambiente entro 30 min di collezione. Rimuovere il plasma e dosaggio immediatamente o aliquota in polipropilene per microcentrifuga e conservare i campioni a ≤ -20 ° C. Preparazione dei campioni supernatante di coltura del tessuto Centrifugare il campione per 10 min a 1.500 x g a 4 ° C per rimuovere le cellule e i detriti. Raccogliere il surnatante e dosaggio immediatamente o aliquota in polipropilene per microcentrifuga e conservare a ≤ -20 ° C. Lo scongelamento di congelati campioni biologici scongelare completamente eventuali campioni biologici precedentemente congelati su ghiaccio e vortex brevemente prima dell’uso. Evitare più di 2 cicli di congelamento/scongelamento. Nota: I campioni utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti coltivando splenocytes del topo BALB/c (1 x 10 6 cellule a 37 ° C + 5% CO 2 in varie condizioni: stimolate, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL-rivestita) + αCD28 (1 µ g/mL solubile), PMA (20 ng/mL) + ionomicina (500 ng/mL). Surnatanti sono stati raccolti dopo 48 h e trattati come descritto nella sezione 1.3. 2. Preparazione dei reagenti Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized perle Sonicate premiscelati perline bottiglia per 1 min in un bagno sonicatore a temperatura ambiente e poi vortice per 30 prima di s da utilizzare. Se nessun bagno sonicatore è disponibile, aumentare il tempo di vortice per 1 min. Preparazione del tampone di lavaggio portare il 20x tampone di lavaggio (20x PBS con 1% Tween-20) fornito con il kit a temperatura ambiente e mescolare nel vortex per portare tutti i sali in soluzione. Diluire 25 mL di tampone di lavaggio con 475 mL di acqua deionizzata: 20x. Parte inutilizzata del negozio tra 2 ° C e 8 ° C fino ad un mese. Preparazione della matrice B (per l’uso con siero e Plasma campioni solo) aggiungere 5,0 mL di tampone (PBS con 1% BSA) incluso nel kit per il flacone contenente il liofilizzato Matrix B. Consenti almeno 15 min per reconst completa ituation, poi vortice per mescolare bene. Avanzi B Matrix ricostituita può essere conservata a ≤-70 ° C fino ad un mese. 3. Preparazione standard Nota: ciascun analita in questo pannello ha una concentrazione di standard superiore di 10.000 pg/mL. Aggiungere 250 µ l di tampone di dosaggio per ricostituire il liofilizzato Mouse Th citochina Standard Cocktail. Mescolare nel Vortex brevemente e lasciare riposare il flaconcino a riposare a temperatura ambiente per 10 min. Trasferire il cocktail standard ad un tubo del microcentrifuge in polipropilene etichettato " C7 ". Questo verrà utilizzato come parte superiore standard. Etichetta 6 microcentrifuga in polipropilene come C1, C2, C3, C4, C5 e C6. Aggiungere 75 µ l di tampone di dosaggio a ciascuno di questi tubi. Trasferire 25 µ l del top standard C7 C6 tubo e mescolare bene di Vortex. Questo sarà lo standard C6. Continua esecuzione seriale diluizioni 1:4 utilizzando una pipetta nuova punta per ogni provetta aggiungere 25 µ l di standard precedente al 75 µ l di tampone di dosaggio nel successivo più basso tubo standard seguito nel Vortex per ottenere norme C5, C4, C3 , C1 e C2. Utilizzare il tampone del saggio come standard 0 pg/mL (C0). 4. Diluizione di esempio Nota: esperimenti pilota preliminari usando questa analisi con diluizioni multiple possono essere richiesti per determinare il fattore di diluizione più appropriato per un particolare set di campioni biologici. Un fattore di diluizione corretta produrrà calcoli di concentrazione per l’esempio che si trovano all’interno dei limiti della curva standard. I passaggi seguenti sono da intendersi come linee guida e potrebbe essere necessario essere determinata empiricamente a seconda del tipo di campione. Diluire siero o plasma campioni 2 volte con tampone di dosaggio (ad es. Diluire 50 µ l di campione con 50 µ l di tampone del saggio) in polipropilene per microcentrifuga. Nota: Se è necessarie ulteriori diluizione del campione, diluizioni devono essere eseguite con matrice B invece di tampone per garantire misure accurate. Aggiungendo i campioni di siero o plasma senza diluizione si tradurrà in accuratezza basso dosaggio e possono ostruire la piastrina filtro. Matrice B è composto da siero di topo in pool impoverito di obiettivi di analisi endogena. Utilizzarlo come un campione di siero o plasma diluente per evitare effetti di matrice, che sono conosciuti per la sensibilità analitica di effetto di test immunodiagnostici. Il campioni surnatante cultura senza diluizione di celle test. Nota: I livelli di analita possono variare notevolmente da campione a campione. Se necessario, diluire i campioni surnatante usando una preparazione fresca del loro terreno di coltura cellulare corrispondente o tampone. 5. Procedura di analisi Nota: il dosaggio può essere effettuato in piastre filtranti in polipropilene, tubi micro FACS o piastre microtiter fondo V. La procedura del dosaggio piastra filtro è consigliata per buono campione a campione, coerenza, test di robustezza e maneggevolezza. Questa procedura richiede un’unità di filtrazione sotto vuoto per il lavaggio (fornito dall’utente finale). Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 ° C) prima dell’uso. Insieme la piastrina filtro sulla copertina di un piastra capovolta in ogni momento durante la procedura di installazione e incubazione di dosaggio, affinché il fondo del piatto non toccare le superfici come può causare perdite. Tenere la piastra in posizione verticale durante la procedura di dosaggio intero, comprese le fasi di lavaggio, per evitare di perdere perle. Tenere la piastra in scuro o avvolto con carta stagnola per tutte le fasi di incubazione. Eseguire tutti gli standard ed i campioni come duplicati, disposti sul piatto in un ordine sequenziale. Pre-bagnato la piastrina filtro aggiungendo 100 µ l di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto e lasciare riposare per 1 minuto a temperatura ambiente (se si utilizza il filtro-fondo micropiastre). Volume di tampone di rimuovere utilizzando il collettore del vuoto (5-10 s). Non superare i 10 " Hg di vuoto. Lavaggio in eccesso della macchia Del buffer dalla parte inferiore della piastra premendo la piastra su una pila di asciugamani di carta pulita. Posizionare la piastra sopra il coperchio piastra capovolta. Nota: Passaggi 5.1-5.2 possono essere omesso se il dosaggio utilizzando un fondo V micropiastra o micro tubi di FACS. Per campioni supernatante di coltura di cellule, aggiungere 25 µ l di tampone ai pozzetti. Aggiungere 25 µ l di ogni standard ai pozzetti standard. Aggiungere 25 µ l di ogni campione per pozzetti. Per la misurazione di campioni di siero o plasma, aggiungere 25 µ l di matrice B pozzetti standard. Aggiungere 25 µ l di tampone ai pozzetti. Aggiungere 25 µ l di ogni standard ai pozzetti standard. Aggiungere 25 µ l di ogni campione di plasma o siero diluito per pozzetti. Vortice misto Perline per 30 s. aggiungere 25 µ l di perline miste in ciascun pozzetto, scuotendo la bottiglia di perlina a intermittenza per evitare perlina sedimentazione. Il volume finale dovrebbe essere 75 µ l in ogni pozzetto dopo l’aggiunta di perline. Sigillare la piastra con un foglio sigillante. Avvolgere l’intera piastra, compresa la copertina di piastra capovolta, con foglio di alluminio. Collocare la piastra su un agitatore per piastre, fissarlo e agitare a circa 500 giri/min per 2 h a temperatura ambiente. Onde per evitare perdite, non applicare pressione positiva per il copripiastra. Senza invertire, posizionare la piastra sul collettore di aspirazione e applicare il vuoto come prima e aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto. Rimuovere il contenuto dei pozzetti della piastra dosaggio di filtrazione sotto vuoto. Asciugare il tampone di lavaggio in eccesso dalla parte inferiore della piastra con un tampone assorbente o carta assorbente. Ripetere questo passaggio un’altra volta. Nota: Se il test viene fatto utilizzando un fondo V e FACS per micropiastre o micro tubi Salta passaggi 5.12 e 5.13. Invece Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 5 min a temperatura ambiente, quindi rimuovere il surnatante con una pipetta multicanale. Aggiungere 25 µ l di anticorpi di rilevamento (Vedi la tabella materiali) in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra con un foglio sigillante fresco. Avvolgere l’intera piastra, compresa la copertina di piastra capovolta, con foglio di alluminio. Collocare la piastra su un agitatore per piastre e agitare a circa 500 giri/min per 1 h a temperatura ambiente. Senza aspirare, aggiungere 25 µ l di reagente di SA-PE direttamente a ciascun pozzetto. Nessuna diluizione del reagente è necessaria. Sigillare la piastra con un foglio sigillante fresco. Avvolgere l’intera piastra, compresa la copertina di piastra capovolta, con foglio di alluminio. Collocare la piastra su un agitatore per piastre e agitare a circa 500 giri/min per 30 min a temperatura ambiente. Ripetere il punto 5.13 sopra. Beh aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio di ciascuno: 1x. Risospendere le perline su un agitatore per piastre per 1 min. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire campioni dalla piastra filtro ai tubi di FACS per leggere i campioni su un citometro a flusso. Nota: Volume del campione può essere aumentato da 200 µ l a 300 µ l con l’aggiunta di un extra 100 µ l di tampone di lavaggio 1X in ogni provetta per evitare il funzionamento a secco di campione. Se necessari campioni possono essere conservati a 4 ° C al riparo dalla luce e analizzato il giorno seguente. Tuttavia, conservazione dei campioni prolungata può portare a ridotta segnale. 6. Set-up Cytometer di flusso Nota: al fine di generare dati affidabili, il citometro a flusso deve essere impostato correttamente prima di acquisizione dati. Questo processo può variare per i singoli utenti in alcuni saluti a seconda della configurazione dello strumento particolare, su che il test viene fatto. Un processo di installazione generalizzata per un citometro in grado di misurare PE e APC e attrezzato con entrambi un laser di 488 e 633 nm viene illustrato di seguito. Avviare il software di acquisizione e citometro a flusso secondo il produttore ' s istruzioni fornite con lo strumento. Crea una stampa di puntino con FSC (forward scatter) sull’asse x e SSC (dispersione laterale) per l’asse y. Impostato sulla modalità lineare FSC e SSC. Crea una seconda stampa di puntino con PE l’ascissa e l’APC per l’asse y. Questa trama deve essere impostata su una modalità di visualizzazione basato su log. Vortex il flaconcino di crudi perline inclusi nel kit per 30 s per risospendere le perline. Queste sfere contengono un colorante APC interno e sono costituite da due popolazioni di dimensioni. Trasferire 400 µ l dei branelli crudi ad un nuovo tubo di FACS. Impostare il tasso di flusso cytometer di flusso basso. Eseguire le perline crude, attentamente regolando il guadagno e la tensione per FSC e SSC affinché entrambe le popolazioni di dimensioni di queste perle sono visibilmente separati e facile al cancello. Regolare la soglia FSC per escludere gli eventi indesiderati (cioè detriti o aria bolle). Plot in the FSC e SSC, disegnare un cancello che include tutte le popolazioni del branello. Nota: Le perle di crude contengono due popolazioni di dimensioni di perline, il più piccolo " branelli " e il più grande " della perla B " regioni. Visualizzare le popolazioni di perlina gestita dal plot FSC e SSC sulla trama del seconda punto con PE l’ascissa e l’APC per l’asse y. Regolare la tensione PMT per il canale di fluorescenza di APC, in modo che il segnale APC per tutte le popolazioni del branello ha un’intensità di fluorescenza media (MFI) che si trova tra 1 x 10 1 e 5 x 10 3. Vortex il flaconcino dell’installazione PE perline per 30 s per risospendere i branelli. Trasferire 400 µ l del PE perle ad un nuovo tubo di FACS. Sostituire le perline raw tube dal citometro a flusso con il PE perline tubo. Regolare la tensione di fotomoltiplicatore (PMT) tubo per il PE fluorescenza canale impostazione in modo che l’IFM di perline PE cade tra la gamma di lotto trovata elencati sul flacone perline PE. Nota: Le perle di installazione PE contengono perle di dimensioni di una popolazione (" branelli " solo). 7. Acquisizione dati Nota: le procedure esatte associate all’acquisizione di dati su un determinato strumento può variare e dipendono il citometro ' s configurazione specifiche e il software di interfaccia utilizzata. Le istruzioni riportate di seguito sono pertanto destinate per evidenziare i passaggi necessari da adottare nell’analisi indipendentemente il citometro impiegato nel dosaggio. Verificare la portata del citometro è ancora impostata su basso. Impostare il numero di eventi di tallone per essere acquisita a circa 300 all’analita. Per un 13-plex pannello questo equivale all’acquisizione di 3.900 eventi combinati da entrambe le popolazioni dimensioni di perle (perle di A + B). Vortex ciascun campione per 5 s prima dell’analisi. Lettura campioni. Durante la lettura di campioni, innanzitutto impostare il citometro a flusso alla modalità di installazione e attendere che popolazione tallone si stabilizzi prima di passare alla modalità acquisizione. Utilizzare nomi semplici con numerazione consecutiva per i file di dati per facilitare l’analisi dei dati. Esportare solo gli eventi con cancello (A + B perlina regioni) piuttosto che eventi totali. Memorizzare tutti i FCS file nella stessa cartella per ogni dosaggio. Se in esecuzione saggi multipli, creare una cartella separata per ogni dosaggio. < classe p= "jove_title" > 8. Procedere all'analisi dei dati Nota: file il FCS generati sul citofluorimetro dovrebbero essere analizzati utilizzando il software di analisi di dati, che può essere scaricato gratuitamente 14. Installare il software di analisi di dati su un PC. Trasferire tutti i file di test FCS al computer che contiene il software di analisi. Collegare il dongle chiave di licenza (incluso nel kit) in una porta USB del computer. Avviare il software di analisi dati. Scegliere il blu " Aggiungi file " pulsante situato nella parte superiore dello schermo. Passare alla cartella che contiene i file di FCS del dosaggio nella pop-up finestra che appare. Fare clic e trascinare tutti i file di test FCS dalla finestra pop-up per la visualizzazione di software. Ora dovrebbero essere visualizzati tutti i file in un elenco. Scegliere il verde " prossimo " pulsante in basso a destra del display. Fare clic e tenere premuto per trascinare il piccolo blu curva standard tasti (C7 a C0) ai loro file FCS corrispondenti dall’elenco per definire la curva standard. Scegliere il verde " prossimo " pulsante in basso a destra del display per aprire la finestra a comparsa gating. Sul lato sinistro della finestra di gating immettere i nomi di entrambi i A e regioni di perlina B tenore analita obiettivi e loro ID associato perlina (trovato nel manuale fornito con il dosaggio) in ordine crescente. Selezionare lo strumento gating dalla parte superiore della finestra pop-up e usarlo per disegnare 2 cancelli nel plot FSC e SSC, uno intorno le perline A e un secondo attorno le perline di B. Esaminare l’APC vs PE tracciati a dispersione che appaiono sotto il plot FSC e SSC che appaiono. Ci saranno 6 analita nelle perline A (grafico di sinistra) e 7 bande di analita dei granuli di B (grafico di destra). Nota: Cancelli potrebbero essere ridisegnato manualmente selezionando lo strumento gomma nella parte superiore e facendo clic per eliminare un determinato cancello. Lo strumento di gating può quindi essere selezionato e utilizzato per applicare manualmente un cancello nella regione di banda desiderata. Scegliere il verde " OK " pulsante per chiudere il gating finestra pop-up e tornare all’elenco dei file FCS. Definire eventuali diluizioni effettuate ai campioni biologici di destra facendo clic su un determinato file, selezionando " Fold diluizione " dal menu e input il valore corretto. Scegliere il verde " eseguire " pulsante nella parte inferiore destra del display per generare le curve standard per il dosaggio e calcolare le concentrazioni di campioni biologici sconosciuti.