Ce protocole décrit la quantification des cibles multiples de cytokines simultanément dans les surnageants de culture de tissus prélevés de splénocytes de souris stimulés à l’aide de perle multiplex immunodosage base plate-forme et un cytomètre en flux.
Perle immunologiques utilisent le même principe de base que les immuno-essais “sandwich”. Capture de billes, qui peuvent être différenciés par la taille et l’intensité de fluorescence allophycocyanin interne (APC), sont conjugués d’anticorps spécifiques d’un analyte spécifique. Ensuite, un groupe sélectionné de capture définies perle ensembles est incubé avec un échantillon biologique contenant des analytes cibles spécifiques à l’anticorps de capture. Un anticorps de détection biotinylé cocktail est ajouté, ce qui conduit à la formation des sandwichs de perle-analyte-détection anticorps de capture.
Enfin, streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) est ajoutée, qui se lie à l’anticorps de détection biotinylés, fournissant les intensités du signal fluorescent proportionnellement à la quantité d’analyte lié. Le PE fluorescent signal des régions de l’analyte spécifique perles quantifiée à l’aide de cytométrie en flux et les concentrations d’analytes particulière sont déterminées à l’aide du logiciel d’analyse de données et la courbe d’étalonnage générée lors de l’essai.
Dans cette expérience, nous utilisons un panneau de cytokines de souris T helper pour quantifier simultanément la concentration de 13 cibles de cytokines distinctes dans les surnageants de culture de tissus prélevés de splénocytes de souris cultivées dans différentes conditions de stimulation.
En tant que molécules de signalisation solubles, cytokines médier les processus hautement coordonnées et multifactorielles qui régissent les réactions immunologiques de l’hôte. Ils sont exprimés durant toutes les étapes du processus inflammatoire, de l’initiation à la résolution et régulent un réseau d’interactions complexes qui comporte leur propre synthèse et celle de leurs récepteurs cellulaires1. Ce réseau de communication est posé avec une complexité qui dépasse les relations synergiques ou antagonistes qui peuvent exister entre les différents composants. En effet, nombreuses cytokines sont connus pour partager les fonctions redondantes ou au moins partiellement superposés2,3.
Approches de la biologie des systèmes intégrés qui quantifient simultanément plusieurs analytes de cytokine fournissent actuellement une compréhension plus complète de le cytokinomes unique qui orchestrent les réponses immunitaires sous-jacente aux maladies multiples dispose de4,5. Ces États de maladie s’étendent d’une inflammation généralisée au cancer, neuro-dégénératives et les maladies cardiovasculaires6,7,8,9.
Ces réseaux de cytokines peut être interrogées efficacement à l’aide de LEGENDplex perle immunologiques. Ces tests sont basés sur le même principe que le sandwich enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) et utilisent des microsphères de fluorescence encodé avec des anticorps de capture de façon covalente à leur surface. Ces anticorps sont immobilisées sur des surfaces beaucoup plus petites que celles requises par les formats traditionnels de ELISA. Cela permet à ces tests d’être interprétée avec beaucoup moins volume de l’échantillon, alors qu’en même temps réduisant non-spécifiques contraignant et fournissant multiplexés analyse plusieurs analytes.
Le test décrit dans ce protocole utilise cette technologie pour doser jusqu’à 13 cibles simultanément. Données de cet essai peuvent être obtenues en utilisant une grande variété de cytomètres couramment disponibles et contrairement à d’autres tests disponibles ne nécessitent pas l’utilisation de l’instrumentation de test spécifique dédiée. Avec un catalogue en pleine expansion des panneaux de l’analyte validés, ces tests ont été utilisés dans plusieurs travaux de recherche biomédicale projets10,11,12,13.
Pour démontrer la facilité et l’utilité du format dosage, dans cette expérience que nous permet de quantifier un panel de cytokine souris T helper 13 distincts des concentrations de cytokine de surnageants de culture de tissus obtenus à partir des splénocytes de souris cultivées sous multiple conditions de stimulation. Outre les surnageants de culture de tissus, ce test peut également être effectué en utilisant des échantillons de sérum ou de plasma.
Le format d’essai décrit dans le présent protocole peut fournir robuste quantification des profils de médiateur soluble dans des échantillons biologiques fournis l’expérimentateur a bon laboratoire technique et adhère au protocole recommandé.
Il y a plusieurs étapes clés qui doivent être suivies pour garantir des résultats fiables. Tout d’abord, les normes recombinants doivent pouvoir reconstituer dans du tampon le recommandé à plein temps et après seulement dilué dans des tubes en polypropylène. Tubes polystyrène peuvent favoriser l’adhérence des protéines de la paroi des tubes, qui peuvent conduire à des signaux faibles lors de la génération de la courbe d’étalonnage. Deuxièmement, secouer pendant les étapes d’incubation adéquate est essentielle. Sans agitation appropriée, les caractéristiques de liaison, des perles d’essai peuvent être gravement entravées. En outre, lavage correcte entre les étapes d’incubation est également requis. L’expérimentateur doit s’assurer que les excès réactifs soient écartés les puits avant de commencer l’étape suivante dans le protocole. Paramètres d’instruments pour le cytomètre en flux utilisés pour interroger les perles de dosage doivent être optimisés aussi bien. En particulier, les paramètres de PMT doivent être réglées de manière séparation appropriée de perle et des plages dynamiques larges pour les courbes standards. Enfin, juste avant d’être analysés sur le cytomètre, les billes doivent être mixés pour assurer une suspension adéquate et d’éviter la formation d’agrégats qui peuvent fausser les résultats.
Ce protocole peut être potentiellement modifié pour analyser des homogénats de tissus ainsi que les types d’échantillons examinés dans ce manuscrit, pourvu que le chercheur est prêt à optimiser leur protocole de lyse avant d’effectuer des essais de plaque grand, plein. La technique réelle dépendra bien sûr de type tissulaire ; Cependant, en général le protocole doit utiliser un tampon de pH neutre contenant des concentrations physiologiques des sels ioniques, sans dénaturation des produits chimiques et préférence pas de détergent. Si un détergent doit être utilisé, les concentrations de détergent non ionique doivent être maintenues au minimum (par exemple pas plus de 1 %). La mémoire tampon doit également contenir des antiprotéases suffisante pour empêcher la dégradation protéolytique de protéines cibles. Quel que soit le protocole de lyse utilisé, les derniers préparatifs doivent être centrifugés pour enlever les particules avant l’analyse.
Au sujet des limites de dosage, les concentrations d’analytes cibles dans types d’échantillons biologiques peuvent varier grandement. Afin de correctement quantifier les concentrations de la substance à analyser, ils doivent être comprise entre les valeurs inférieure et supérieure pour la courbe d’étalonnage. Extrapolation des valeurs de la courbe n’est pas nécessairement fiable et n’est pas recommandé. Les enquêteurs doivent donc optimiser dilutions de leurs échantillons particuliers dans des expériences pilotes avant d’exécuter une analyse complète-plaque. En outre, la préparation minutieuse des échantillons biologiques à doser est primordiale pour le succès de ce format de test. Échantillons lipémiques, hémolysés, ou contenant des débris de la protéine seront affectent les interactions anticorps antigène qui définissent le principe essentiel de ce test immunologique et restituer des résultats ininterprétables.
Ce test est significatif en ce qui concerne les méthodes de quantification existantes pour plusieurs raisons. Lorsque exécuté correctement, le format du test peut doser jusqu’à 13 analytes auprès d’un échantillon en utilisant des volumes beaucoup plus faible qu’il faudrait analyser l’échantillon à l’aide des tests ELISA traditionnelles. Ce format d’essai ne nécessite pas instrumentation dédiée afin d’être exécutée. Il s’agit d’un avantage par rapport aux autres immunologiques perle disponibles dans le commerce comme le dosage peut être exécuté à l’aide de n’importe quel nombre de cytomètres couramment utilisés.
Une enquête scientifique sur le rôle joué par les cytokines et facteurs sécrétés réseaux en santé et la maladie se développe. Le format de test décrit dans ce manuscrit peut être un outil précieux pour les chercheurs qui cherchent à comprendre ces phénomènes complexes et multiformes. Programmes de recherche biomédicale active commencent à explorer le rôle des réseaux de cytokines de l’inflammation tels que généralisés des zones non seulement6, mais aussi en contexte des États de maladie spécifiques telles que l’athérosclérose, le cancer et neuro-inflammation 15,16,17. Sans aucun doute, enquête va continuer à croître dans ces domaines comme la recherche de nouvelles thérapies traiter ces affections chroniques se développe. La nécessité d’une quantification précise et fiable des médiateurs solubles associés à ces maladies demeurera une priorité de recherche critique.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à souligner les contributions des biomarqueurs et Immuno-essais équipe de développement de produits pour le développement du dosage. En outre, nous tenons à remercier Vigene Tech, Inc. pour leurs efforts de collaboration dans la conception de progiciels des analyse les données.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |