Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal

Prionziekten of overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE) zijn neurodegeneratieve aandoeningen, met inbegrip van Creutzfeldt – Jacob (CJD) bij mensen, boviene spongiforme encefalopathie (BSE) bij runderen, scrapie bij schapen en geiten, en chronische verspillen ziekte (CWD) bij hertachtigen ^1,2. TSE’s worden gekenmerkt door onderscheidende spongiforme uiterlijk en verlies van neuronen in de hersenen. Volgens de “alleen eiwit” hypothese, zijn prionen voornamelijk samengesteld uit PrP^Sc (‘Sc’ voor scrapie) ³, een misfolded isovorm van het host-gecodeerde cellulaire prion-eiwit, PrP^C. PrP^Sc vloeit voort uit de omzetting van PrP^C in een conformatie verrijkt in ᵦ-bladen ^4,5,6 die kan fungeren als een zaadje om te binden en converteren van andere PrP^C moleculen. De nieuw gegenereerde PrP^Sc -moleculen worden opgenomen in een groeiende polymeer ^7,8 die in kleinere oligomeren breekt, wat resulteert in hogere nummers van besmettelijke kernen. PrP^Sc is gevoelig voor aggregatie en is gedeeltelijk resistent tegen proteasen ^9,10.

CWD beïnvloedt wilde en gekweekte elanden (Cervus canadensis), muildierhert (Odocoileus hemionus), Witstaarthert (WTD; Odocoileus virginianus), elanden (Alces alces), en (Rangifer dierkunde dierkunde) rendier ^11,12,13. Het wordt beschouwd als de meest besmettelijke prionziekte met horizontale overdracht begunstigd door cervid interacties en milieu persistentie van infectiviteit ^14,15. In tegenstelling tot andere prionziekten waar PrP^Sc accumulatie en infectiviteit zijn beperkt tot de hersenen, in CWD zijn deze ook gevonden in perifere weefsels en lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, urine en ontlasting ^{16,17, 18}.

Immunohistochemistry wordt beschouwd als de gouden standaard voor CWD diagnose om PrP^Sc distributie en spongiforme laesies ^19,20te detecteren. ELISA en in meer zeldzame gevallen, westelijke vlek zijn ook gebruikt voor CWD diagnostiek. Huidige prion ziekten diagnose is dus voornamelijk gebaseerd op het opsporen van prionen in post mortem weefsels. Ante mortem diagnose voor CWD is beschikbaar door middel van amandelen of biopsieën recto-anale mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsel (RAMALT); echter, deze procedure is invasieve en vereist het vangen van de dieren. Dus, zou het gebruik van gemakkelijk toegankelijke specimens, zoals urine en ontlasting, een praktische manier voor CWD prion detectie. Echter, deze haven uitscheidingsproducten relatief lage concentraties van prionen onder de detectiegrens van huidige diagnostische methoden. Bijgevolg is een gevoeliger en hoge doorvoer diagnostische tool noodzakelijk. In vitro conversie systemen, zoals eiwit misfolding cyclische amplificatie assay (PMCA) ²¹, amyloid seeding assay, en real-time schokkend-geïnduceerde conversie (RT-QuIC) assay ^{22,23, 24} zijn zeer krachtige hulpmiddelen te exploiteren de zelf teeltmateriaal vermogen van PrP^Sc na te bootsen in vitro het prion-conversieproces en daardoor het versterken van de aanwezigheid van minieme hoeveelheden van PrP^Sc naar detecteerbare niveaus ^{25 ,26}. De RT-QuIC methode, maar profiteert van het feit dat het product van de conversie verrijkt met β-sheet secundaire structuur specifiek thioflavin T (Th-T) kunt binden. Daarom groeit recombinante PrP (rPrP) bij de geplaatste conversie uit tot amyloïde fibrillen die Th-T binden en dus in real time kunnen worden gedetecteerd door het meten van de fluorescentie van Th-T uitgedrukt als relatieve fluorescentie eenheden (RFU) na verloop van tijd. Zodra gecontroleerd, kan de RFU worden gebruikt om te evalueren van de relatieve seeding activiteiten en kwantitatieve parameters zoals de lag-fase. De lag-fase vertegenwoordigt de (h) benodigde tijd voor het bereiken van de drempel, tijdens welke rPrP conversie in het vroege stadium van de reactie onder de detectiegrens van Th-T fluorescentie is. Het einde van de fase van de schijnbare lag, gelijktijdige tot de vorming van een voldoende amyloïde nucleus (nucleatie/rek), vindt plaats wanneer de Th-T fluorescentie groter is dan de drempelwaarde en positief. De groei van amyloid fibrillen kunnen worden opgespoord in real time en de eerste PrP^Sc of seeding activiteit opgenomen in de steekproef wordt versterkt door de segmentatie die meer zaden genereert. Deze zaden induceren op zijn beurt een snelle exponentiële groeifase amyloïde vezel.

Omdat deze test is het kundig voor speurder zo laag als 1 fg van PrP^{Sc 24}, de hoge gevoeligheid kwalificeert deze techniek om antemortem- of niet-invasieve diagnose door het detecteren van PrP^Sc in de verschillende perifere weefsels, uitscheidingsproducten of andere soorten specimen lage niveaus van infectiviteit herbergen. RT-QuIC biedt zeker voordelen ten opzichte van andere testen voor de reproduceerbaarheid, bruikbaarheid, snelheid (minder dan 50 h) en lage kosten in vergelijking met bioassays. Het vermijdt de technische complexiteit zoals ultrasoonapparaat gebruikt in PMCA; het wordt ook uitgevoerd in een tape-verzegeld microplate die het risico van aërosol besmetting van elk putje minimaliseert. De multi goed indeling maakt het mogelijk de analyse van maximaal 96 monsters in hetzelfde experiment. Om het steeds terugkerende probleem van valse positieven en spontane omzetting van rPrP in de conversie in vitro testen tegen te gaan is de uitvoering van een drempel (cut-off) in RT-QuIC erg handig. Inderdaad, op basis van de resultaten van de negatieve controle (gemiddelde RFU van negatieve monsters + 5 SD ²⁷), een basislijn wordt ingesteld waarmee discriminatie tussen de positieve en negatieve monsters kan worden gedaan. Het gebruik van vier replicatieonderzoeken voor elk monster kan dus helpen om een monster positief wanneer ten minste 50% van de duplo’s een positief signaal tonen, dat wil zeggen over de licht-donkerscheiding ²⁸. De homologie tussen zaad en substraat is niet vereist in RT-QuIC, zoals bijvoorbeeld in een eerdere studie, hamster rPrP bleek te zijn een gevoeliger substraat in vergelijking met het homologe substraat in menselijke PrP^vCJD zaadjes en schapen scrapie agarvoedingsbodem reacties ²⁹. hamster-schapen chimeer rPrP werd ook voorgesteld als een meer geschikt substraat dan menselijke rPrP te sporen van menselijke variant Creutzfeldt-Jakob prionen ³⁰. Dus, het gebruik van rPrP substraten uit verschillende soorten is heel gebruikelijk in deze test. Deze bepaling is met succes toegepast op verschillende prionziekten, zoals de sporadische CJD ^31,32,33, geneTIC prion ziekten ³⁴,^36,37van de ^35,van de BSE- en scrapie ^23,36CWD ^{38,39,40,41, 42}. Studies met verwerkt cerebrospinale vloeistof, bloed, speeksel en urine zoals zaden in RT-QuIC allen succesvol waren te detecteren PrP^{Sc 38,39,40,41, 42}. ter bevordering van de detectie mogelijkheid in monsters zoals bloedplasma die remmers van amyloïde formatie bevatten kan, Orrú et al. (2011) een strategie om te verwijderen van potentiële remmers van amyloïde vorming door te kammen PrP^Sc immunoprecipitation (IP) stap en RT-QuIC ontwikkeld, genaamd “versterkte QuIC” assay (eQuIC). Daarnaast een substraat vervanging stap werkte na ~ 24 h van reactietijd ter verbetering van de gevoeligheid. Uiteindelijk, als laag als 1 ag voor PrP^Sc was aantoonbaar met eQuIC ³⁰.

Fecale monsters verzameld in preklinische en klinische stadia van elk na experimentele mondelinge infectie waren te zuiveren van extracten van de ontlasting mogelijk assay remmers verwijderen in ontlasting, gehomogeniseerd in buffer met detergenten en proteaseinhibitors. De ontlasting-extracten werden verder ingediend bij verschillende methodologieën te concentreren PrP^Sc in de monsters met behulp van eiwit neerslag via natrium phosphotungstic zuur (NaPTA) neerslag. De neerslag van de NaPTA methode, voor het eerst beschreven door Safar et al. ⁴³, wordt gebruikt om zich te concentreren PrP^Sc van analysemonsters. De incubatie van NaPTA met de resultaten van de steekproef in preferentiële neerslag van PrP^Sc in plaats van PrP^C. Het moleculaire mechanisme is echter nog onduidelijk. Deze stap heeft ook geholpen dat bevat en het voorkomen van de spontane omzetting van rPrP, die in sommige gevallen wordt waargenomen. Tot slot, de ontlasting extracten zijn getest door geoptimaliseerde RT-QuIC met behulp van de muis rPrP (aa 23-231) als substraat en met inbegrip van basismateriaal vervanging in het protocol ter verbetering van de gevoeligheid van detectie.

De resultaten hier laten zien dat deze verbeterde methode zeer lage concentraties van CWD prionen detecteren kan en de gevoeligheid van de detectie- en specificiteit in fecale monsters in vergelijking met een protocol zonder neerslag en substraat vervanging van de NaPTA verhoogt. Deze methode kan worden toegepast op andere weefsels en lichaamsvloeistoffen potentieel en kan van groot nut zijn voor toezicht op CWD bij hertachtigen wild en in gevangenschap.