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신경과학

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

Abstract

GABAergic 대뇌 피 질의 수는 흥분 성의 피라미드 뉴런의 출력 조절 피라미드 뉴런 앙상블의 출력을 동기화에 중요 한 역할을 하는 셀의 이종 인구. 정신병 무질서, 정신 분열 증, 자폐증, 간 질 등의 다양 한에서 적자 interneuron 함수에 연루 되었습니다. 배아 줄기 세포 로부터 대뇌 피 질의 수의 뿐만 아니라 그들의 개발 및 기능 연구에 대 한 허용 하지만 대뇌 피 질의 interneuron 관련 장애의 병 인을 기본 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 수는 또한, 마이그레이션, 생존과 호스트 대뇌 피 질의 회로 후 이식, 그들 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 이상적인 후보자를 만들기에 통합 놀라운 능력을가지고. 여기, 우리 Nkx2.1 표현 interneuron 창시자와 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장성, 높은 효율, 수정 embryoid 몸 단층 방법 제시. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 mESC 라인을 사용 하 여, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손 수 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 통해 격리 되며 이후 다운스트림 응용 프로그램의 숫자에 사용. 우리는 또한 방법을 풍부 하 게 parvalbumin (태양광 발전) 또는 somatostatin (SST) interneuron 하위 그룹을 도움이 될 수 있습니다 운명 결정의 측면을 공부 하거나 사용 하기 위해 하위 그룹 농축 interneuron에서 도움이 될 것 이라고 하는 치료 응용 프로그램에 제공 이식입니다.

Introduction

두 생쥐와 인간에 대략 절반 모든 대뇌 피 질의 억제 수 (CIns)의 발생 과도 subcortical 구조 중간 절 예 하 (MGE) 어디 라고 내 CIns 및 다른 신경 그리고 glial의 neuroepithelial 창시자 하위 그룹 표현 녹음 방송 요인 Nkx2.11,2. CIn 하위 그룹 또는 하위 형태학, neurochemical electrophysiological, 교차 및 연결 특성3,4로 정의 됩니다. MGE 파생 된 CIns로 그룹화 할 수 있습니다 대부분 비중첩 하위 PV 또는 SST, 특정 electrophysiological 및 연결 추세5와 어떤 관계가 식의 그들의 식에 따라. 부전 수, PV 비율에서 특히 그들의 여러 정신병 무질서 및 질병6,7에 연루 되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 줄기 세포 유래 mitotic 창시자 및 대뇌 피 질의 interneuron 생물학 연구 및 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 태양광 또는 SST CIn 운명에 대 한 농축 철새 선구자입니다.

Interneuron 창시자 표현 하는 Nkx2.1 및 mESCs에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장 가능한, 매우 능률적인 방법을 개발 했습니다. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP을 사용 하 여 듀얼 기자 mESC 선8, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손은 FACS를 통해 격리 되 고 이후 다운스트림 응용 프로그램의 수에 사용 될 수 있습니다. 다양 한 신호 경로, 문화, 그리고 성체의 모드를 조작 하 여 우리 붙일 레이블된 interneuron 선구자 다운스트림 응용 프로그램의 호스트에 대 한 적합의 수백만 얻을 수 있습니다.

MESCs9,10,11,12,13,14, 의존 하는 Wnt 우리의 방법에서에서 MGE 같은 창시자를 생성 하기 위한 여러 가지 다른 방법 존재 길 항 근 XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 공동 telencephalic 창시자 표현 생성에 특히 효율적입니다. 또한, interneuron 창시자 또는 우리의 듀얼 기자 시스템을 통해 그들의 포스트 mitotic Lhx6 표현 자손에 대 한 선택 수는 크게 고유 창시자 그리고 그들의 자손을 생성 하는 능력을 향상 시킵니다.

Protocol

참고:이 프로토콜에서 설명 하는 듀얼 기자 mESC 라인은 요청 (sande@mail.med.upenn.edu). 1. 미디어 준비 참고: 모든 미디어 세포 배양에 사용 하기 전에 37 ° C를 따뜻하게. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 미디어 (500 mL를 준비) Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 및 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터 449 ml 50 mL 태아 둔감 한 혈 청…

Representative Results

이 문서에 설명 된 프로토콜 우리의 게시 프로토콜15,,1617 의 수정된 된 버전 이며, 우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 mESC 선으로 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. DD0-5, 다시 도금 DD8에서 결합 XAV 939 Wnt 억제제를 추가 하 여 우리는 어떤 점에서 모든 DAPI + 핵 문화에서의 50% 이상을 또한 Nkx2.1 표현 (<s…

Discussion

이 메서드는 J1 파생 된 mESCs (SCRC-1010) 패턴에 매우 효과적인, 우리 다른 mESC 라인과 클론 분리 변수 성공을 경험 했다. 예를 들어, Foxg1::venus mESCs (EB3 파생; Danjo 외. 이 프로토콜을 Foxg1 DD12에 의해 유도 제대로 13) 응답은 일반적으로 1-2%의 순서. 이유로 우리가 완전히 이해 하지 않는 또 다른 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 클론 (나 JQ59) (JQ27 불리)이이 프로토콜에서 설명 하는 라…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는이 프로토콜을 개발 하는 데 도움에 그들의 초기 작업에 대 한 Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP 듀얼 기자 mESC 라인으로 제니퍼 타이슨, Asif Maroof 및 팀 페트 로스를 개발 하기 위한 청나라 Xu에 감사. 우리는 또한 빨리 흐름 cytometry 핵심을 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 MH066912 (SA)와 F30 MH105045-02 (DT)에 의해 지원 되었다.

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
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References

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Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
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