JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

Abstract

GABAergic interneurons בקליפת המוח הם אוכלוסיה הטרוגנית של תאים לשחק תפקידים חיוניים המסדיר את הפלט של נוירונים כפירמידה סינאפסות, כמו גם סינכרון התוצרים של נוירון כפירמידה הרכבים. הגירעונות בתפקוד interneuron היו מעורבים במגוון מנוטלי הפרעות, כולל סכיזופרניה, אוטיזם, אפילפסיה. ההטיה של interneurons קורטיקלית מתאי גזע עובריים לא רק מאפשר לחקר ההתפתחות והתפקוד שלהם, אך מספק תובנה המנגנונים המולקולריים שבבסיס בפתוגנזה של הפרעות הקשורות interneuron קורטיקלית. Interneurons יש גם יכולת יוצאת דופן כדי לשרוד, להעביר, ולשלב מארח המעגלים קורטיקלית שלאחר ההשתלה, שהופך אותם מועמדים אידיאליים לשימוש בטיפולים מבוססי תאים. כאן, אנו מציגים מדרגיים, יעיל ביותר, ששונה embryoid גוף-כדי-טפט שיטה ההטיה של ביטוי Nkx2.1 אבות interneuron, הצאצאים שלהם מן בתאי גזע עובריים בעכבר (mESCs). באמצעות קו mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP כתב כפול, Nkx2.1 אבות או צאצאיהן שלאחר mitotic לבטא Lhx6 יכול להיות מבודדים באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ולא משתמשים לאחר מכן במספר יישומים במורד הזרם. כמו כן אנו מספקים שיטות כדי להעשיר parvalbumin (PV) או somatostatin (SST) interneuron קבוצות, אשר עשוי להיות שימושי חוקרת היבטים של נחישות הגורל או לשימוש ביישומים טיפולית ירוויחו interneuron מועשר קבוצת משנה השתלות.

Introduction

הן בעכברים ובבני אדם, בערך מחצית כל קורטיקלית מעכבות interneurons (CIns) מקורם בתוך מבנה subcortical ארעית הידועה בשם קדושתו ganglionic המדיאלי (MGE), שבו המוצא לאגס neuroepithelial CIns אחרים עצביים ו גליה קבוצות מבטאים את הפקטור שעתוק Nkx2.11,2. CIn חבורות או תתי סוגים מוגדרים על-ידי מצטלבים מורפולוגי, עצבית, אלקטרופיזיולוגיות וקישוריות מאפיינים3,4. CIns MGE, נגזר ניתן לקבץ קבוצות בעיקר שאינם חופפים בהתבסס על הבעת רגשותיהם PV או SST, הביטוי של אשר בקורלציה עם מסוים אלקטרופיזיולוגיות וקישוריות נטיות5. תפקוד לקוי של interneurons, במיוחד אלה בקבוצת המשנה PV, היה מעורב במספר מנוטלי הפרעות ומחלות6,7. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר תאי גזע-derived אבות mitotic ו מבשרי נודדות מועשר לגורל PV או SST CIn ללמוד ביולוגיה interneuron קורטיקלית, לשימוש בטיפולים מבוססי תאים.

פיתחנו שיטה מדרגי, יעילה במיוחד עבור ההטיה של ביטוי Nkx2.1 אבות interneuron, הצאצאים שלהם מן mESCs. באמצעות Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP של הכתב כפול mESC קו8, Nkx2.1 אבות או צאצאיהן שלאחר mitotic לבטא Lhx6 יכול להיות מבודדים באמצעות FACS משתמשים לאחר מכן במספר יישומים במורד הזרם. על-ידי מניפולציה מספר איתות המסלולים, משך הזמן של תרבות, ומצב של נוירוג’נסיס, אפשר להשיג מיליוני interneuron fluorescently שכותרתו מבשרי מתאים שורה של יישומים במורד הזרם.

למרות מספר שיטות אחרות קיימות ליצירת MGE כמו אבות מ mESCs9,10,11,12,13,14, השיטה שלנו, אשר נשענת על חגיגת אנטגוניסט מבצע של-939, יעיל במיוחד-יצירת שיתוף לבטא אבות telencephalic Foxg1/Nkx2.1. בנוסף, היכולת לבחור interneuron אבות או פוסט mitotic לבטא Lhx6 הצאצאים שלהם באמצעות מערכת כפולה הכתב שלנו, משפר באופן משמעותי את היכולת ליצור אבות ברורים, הצאצאים שלהם.

Protocol

הערה: קו mESC כתב כפול שמתואר פרוטוקול זה הינו זמין לפי בקשה (sande@mail.med.upenn.edu). 1. הכנה מדיה הערה: חמים כל המדיה עד 37 ° C לפני השימוש בתרבית תאים. העכבר מתחלקים פיברובלסט (MEF) מדיה (עבור הכנת 500 מ) להוסיף 50 מ ל סרום שור עוברית (FBS) 449 מיליליטר של Dulbecco בינ…

Representative Results

את הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא גרסה מותאמת של16,15,שלנו פרוטוקולים שפורסמה17 ואת הותאם לשימוש עם קו כפול-כתב mESC שלנו Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. על ידי הוספת החומר המדכא ונ ט 939-מבצע של DD0-5, בשילוב עם ציפוי מחדש ב- DD8, אנו להשיג חזקים אינד…

Discussion

אמנם שיטה זו יעילה מאוד על תכנים mESCs נגזר J1 (SCRC-1010), שאנו חווים הצלחה משתנה עם קווים mESC אחרים מבודד המשובטים. למשל, Foxg1::venus mESCs (EB3 נגזר; . דאנג’ו et al. תגובה 13) גרוע זה פרוטוקול, אינדוקציה Foxg1 על ידי DD12 הוא בדרך כלל גודל 1-2%. מסיבות שאנחנו לא מבינים לחלוטין, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP עוד כתב כפול…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנחנו מודים שו צ’ינג לפתח את Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP כתב כפול mESC קו, כמו גם ג’ניפר טייסון, אסיף Maroof ו טים פטרוס עבודתם מוקדם על עוזרת לפתח פרוטוקול זה. אנו מודים גם את ליבת cytometry זרימה CHOP לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי, MH066912 R01 NIH (SA) ו F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron ProgenitorsNkx2.1ParvalbuminSomatostatinMEF Feeder CellsTrypsin-EDTAGelatin-coated PlatesKSR-N2 MediaEmbryoid Bodies

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image